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¿Los nucleosomas alguna vez se desenvuelven completamente durante la transcripción?

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En la transcripción eucariota, ¿los nucleosomas alguna vez desenrollarán completamente el ADN y el complejo de histonas se desensamblará? Si un operón tiene más de 160 pares de bases, parece que debe hacerlo.


Sí, los nucleosomas están completamente desenrollados. Las histonas chaperonas como FACT (para H2A / H2B) y ASF1, CAF-1, HIRA, Nucleophosmin, etc. (para H3 / H4), se asocian con RNA Pol II y manejan los nucleosomas desplazados. Como supuso, el complejo octámero de histonas se desarma en el tetrámero H3 / H4 y dos dímeros H2A / H2B. Justo detrás del Pol II que se alarga, las chaperonas vuelven a ensamblar los nucleosomas. Durante el proceso de reensamblaje, se ha demostrado que los "nuevos" dímeros H2A / H2B (y posiblemente también los tetrámeros H3 / H4) pueden incorporarse en un octámero de histona "antiguo". Por último, los complejos de remodelación de nucleosomas como SWI / SNF reespacian los nucleosomas.

Esta es una revisión decente del proceso (por uno de los descubridores del complejo FACT, dicho sea de paso): "Nuevos tipos en el campo de las histonas chaperonas". Campos y Reinberg. Genes & Development (2010): 24: 1334-1338

Esta es una revisión completa de las histonas chaperonas y la dinámica de los nucleosomas durante varios procesos dependientes del ADN (como la transcripción, la replicación y la reparación). Hay una sección completa sobre su papel en la transcripción de genes, que es el tema principal de esta pregunta: "Chaperonas de histonas: ayuda al tráfico de histonas y la dinámica de nucleosomas". Gurard-Levin, Z.A., Quivy, J. y Almouzni, G. Revisión anual de bioquímica (2014): 83: 487-517

Y finalmente, una buena descripción general de la dinámica de las histonas y la estructura de la cromatina durante la transcripción: "Intercambio de histonas, estructura de la cromatina y regulación de la transcripción". Venkatesh & Workman. Nature Reviews Mol. Celda. Biol. (2015): 16: 178-189


Debo agregar que la incapacidad para desmontar los nucleosomas (o desplazar cualquier otro factor unido muy fuertemente al ADN) puede en realidad pausar un complejo Pol II que se alarga.


Solo para agregar información nueva muy reciente a la primera respuesta: los pasos iniciales de la transcripción del ARN Pol II a través de un nucleosoma ahora han sido revelados a nivel estructural por cryoEM.

Vea estos dos artículos:


Metilación de histonas

Metilación de histonas es un proceso mediante el cual los grupos metilo se transfieren a los aminoácidos de las proteínas histonas que forman los nucleosomas, que la doble hélice del ADN envuelve para formar cromosomas. La metilación de histonas puede aumentar o disminuir la transcripción de genes, dependiendo de qué aminoácidos de las histonas estén metilados y cuántos grupos metilo estén unidos. Los eventos de metilación que debilitan las atracciones químicas entre las colas de histonas y el ADN aumentan la transcripción porque permiten que el ADN se desenrolle de los nucleosomas para que las proteínas del factor de transcripción y la ARN polimerasa puedan acceder al ADN. Este proceso es fundamental para la regulación de la expresión génica que permite que diferentes células expresen diferentes genes.


Resumen del autor

En este artículo, examinamos la activación y represión de la transcripción de un gen en levadura. Este gen, como el gen humano típico, está envuelto en paquetes de proteínas de ADN llamados nucleosomas. Se cree ampliamente que estos paquetes condensados ​​se desenvuelven, en un proceso llamado eliminación de nucleosomas, cuando comienza la transcripción. Aquí, describimos un nuevo ensayo cuantitativo de nucleosomas que nos permite medir el curso temporal de la eliminación y el reemplazo de nucleosomas a medida que el gen se activa y reprime. El activador de levadura Gal4, unido al ADN, efectúa la activación de la transcripción genética en dos pasos separados. En primer lugar, recluta al gen una enzima que elimina los nucleosomas y, en segundo lugar (como habíamos demostrado anteriormente), recluta la maquinaria transcripcional. También mostramos que la transcripción del gen puede desactivarse mucho antes de que los nucleosomas hayan regresado al gen. En este caso, el activador continúa reclutando al eliminador de nucleosomas, pero no se recluta la maquinaria transcripcional o, si lo está, se destruye pronto.

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Editor académico: Oliver J. Rando, Facultad de Medicina de la Universidad de Massachusetts, Estados Unidos de América

Recibió: 20 de agosto de 2008 Aceptado: 6 de noviembre de 2008 Publicado: 23 de diciembre de 2008

Derechos de autor: © 2008 Bryant y col. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la Licencia de Atribución Creative Commons, que permite el uso, distribución y reproducción sin restricciones en cualquier medio, siempre que se acredite el autor y la fuente originales.

Fondos: Este trabajo fue apoyado por una subvención de los Institutos Nacionales de Salud a M. Ptashne.

Conflicto de intereses: Los autores han declarado que no existen intereses en competencia.

Abreviaturas: ChIP, inmunoprecipitación de cromatina HS, hipersensible UASg, , secuencia de activación aguas arriba, galactosa


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Discusión

Nuestro ensayo experimental nos permite sondear la posición instantánea de un nucleosoma de forma repetitiva, con una resolución de casi pares de bases y durante largos períodos de tiempo, lo que permite medir la movilidad térmica de los nucleosomas reconstituidos. En particular, nuestras mediciones se basan en sondear la posición de la primera región de interacción del nucleosoma y, por lo tanto, no se puede descartar por completo que los cambios conformacionales en la estructura del nucleosoma desempeñen un papel en el reposicionamiento observado de esta región. De hecho, trabajos previos que sugieren la importancia de la plasticidad del octámero para la dinámica del nucleosoma sugieren que se requieren algunos cambios conformacionales para que el nucleosoma se mueva (3). Sin embargo, nuestros datos sugieren que la dinámica observada es, al menos esencialmente, un movimiento del centro de masa (Apéndice SI). Nuestros resultados indican que, una vez localizados inicialmente (durante la reconstitución in vitro en nuestros experimentos o por la acción de la maquinaria de remodelación en la célula), los nucleosomas canónicos que contienen H2A se someten a difusión confinada, explorando una pequeña región del ADN. La deposición de H2A.Z en el nucleosoma cambia drásticamente sus propiedades de difusión. Además de los pasos de reposicionamiento cortos y frecuentes similares a los observados para los nucleosomas H2A, los nucleosomas H2A.Z exhiben un tipo adicional de paso, menos frecuente pero más largo, que domina el reposicionamiento de los nucleosomas y les confiere la capacidad de superar el confinamiento y trasladar a distancias más largas. Dado que la ruptura simultánea de todas las interacciones entre el octamer y el ADN requeriría una energía de al menos ∼75 kBT (47), los modelos teóricos sugieren que la movilidad espontánea de los nucleosomas está impulsada por defectos estructurales, ya sean bucles (19) o torsiones (21), creados a medida que el ADN se desenvuelve y vuelve a envolver espontáneamente. Aunque la prevalencia de cada tipo de defecto todavía está en debate, está claro que los defectos de torsión, el más probable de 1 pb, deberían formarse más rápido que los bucles, que son energéticamente ventajosos con una longitud de 10 pb. Además, los modelos computacionales recientes predicen que la formación de bucles está restringida a regiones específicas, como SHL ± 2 (48) ubicada entre las regiones 1 y 2 del nucleosoma, pero la torsión excesiva del ADN permite la acomodación de un par de bases adicional adicional que puede posición a lo largo del ADN (49). Por lo tanto, es posible que los dos tipos de eventos de reposicionamiento que reportamos para los nucleosomas que contienen H2A.Z representen la dinámica inducida por los dos tipos de defectos estructurales propuestos: los movimientos a pequeña escala pueden corresponder a los defectos de torsión energéticamente más bajos y más abundantes. , generado en escalas de tiempo de segundo y quizás subsegundos, mientras que los eventos de reposicionamiento de largo alcance que ocurren en escalas de tiempo diminutas podrían corresponder a la dinámica facilitada por la formación de defectos de bucle.

¿Qué hace que los nucleosomas H2A.Z sean distintos? Aunque las estructuras cristalinas de los nucleosomas canónicos y que contienen H2A.Z son similares, existen varias diferencias clave. En particular, las interacciones del tetrámero H3 / H4 con el dominio de acoplamiento de H2A.Z se desestabilizan debido a la sustitución de una glutamina por la glicina más pequeña en la posición 104 en H2A.Z (50). A la luz de estudios recientes que indican que el reposicionamiento térmico del nucleosoma requiere plasticidad del octámero (51), proponemos que dicha plasticidad se puede lograr mediante la desestabilización del dominio de acoplamiento H2A.Z / H2B, lo que conduce a cambios conformacionales en el octámero de histonas. Dichos cambios afectarán no solo las interacciones locales entre el tetrámero H3 / H4, sino que también pueden propagarse alostéricamente a las interacciones del octamer con el ADN. En apoyo de esta hipótesis, nuestro trabajo anterior reveló una disminución en la fuerza de la interacción H3 / H4 con el ADN tras la incorporación de H2A.Z (34).

Al medir simultáneamente la posición del nucleosoma y la presencia de un TF unido en el sitio de unión para Egr-1, hemos demostrado que los movimientos espontáneos del nucleosoma, y ​​en particular los eventos de reposicionamiento prolongados típicos de los nucleosomas H2A.Z, modulan la exposición del sitio de unión de Egr-1 y así modular la unión de TF al ADN (Fig. 5). En el contexto de la regulación transcripcional, esto puede servir como un medio para ajustar la accesibilidad basal, en contraposición al efecto más drástico que resulta de la creación de una región empobrecida en nucleosomas. Facilitado por las propiedades intrínsecas del nucleosoma e independiente de otros factores, este mecanismo puede controlar la unión inicial de un TF pionero para reclutar maquinaria de remodelación en un locus de ADN específico. Curiosamente, esta posibilidad está en línea con estudios previos que demostraron que los nucleosomas H2A.Z son necesarios para el reclutamiento de TF pioneros (26, 52, 53). Específicamente para el Lhb gen, el sitio de unión de Sf-1, ubicado en −119 / −127 y responsable de la diferenciación gonadotrópica y la activación basal de Lhb (54), también reside dentro del nucleosoma. Es posible que la unión pionera de Sf-1 sea facilitada por la exposición de este sitio de unión, inducida por la movilidad del nucleosoma.

Un modelo para la interacción entre la difusión inducida por H2A.Z y la unión de TF. Los nucleosomas experimentan una difusión confinada en el ADN y limitan la unión de un TF. La incorporación de la variante de histonas H2A.Z sirve para aliviar parcialmente este confinamiento, mediante un tipo diferente de difusión térmica. El aumento de la difusión conduce a la exposición del sitio de unión del TF y facilita su asociación con el ADN. El TF unido luego restringe los movimientos nucleosomales corriente arriba, sesgando así asimétricamente el reposicionamiento corriente abajo.

Observamos que la unión de TF sesga la dirección de la movilidad lejos del sitio de unión. Aunque es posible que esto sea el resultado de interacciones estéricas entre el nucleosoma y el TF unido, también es posible que la unión del TF suprima la formación de bucles o giros modificando localmente las propiedades mecánicas del ADN. En cualquier caso, el efecto de la unión de TF sobre la movilidad sugiere que la unión puede servir como un mecanismo autorregulador para aumentar aún más la accesibilidad de TF. Además, esto puede proporcionar la base para la cooperatividad mediada por nucleosomas en la unión de diferentes TF, ya que la unión de un TF puede modificar la accesibilidad de otro sitio de unión de TF. En conjunto, esto hace que el uso de un nucleosoma móvil sea un mecanismo de regulación más versátil y potente que simplemente cambiar la posición del nucleosoma.

En una perspectiva más amplia, los nucleosomas móviles pueden explotarse para facilitar distintos resultados cuando se incorporan en regiones genómicas específicas durante diferentes contextos biológicos. Se demostró que H2A.Z se localiza en regiones distintas de los promotores de genes, entre ellas regiones potenciadoras (54), regiones de heterocromatina (29) y sitios de daño del ADN (55). Dado que estos procesos requieren una amplia accesibilidad al ADN para mantener importantes actividades celulares, es probable que la incorporación de H2A.Z desempeñe un papel en el establecimiento de los cambios a largo plazo que autosustentan la accesibilidad basal de las regiones del ADN durante períodos prolongados. Por último, la incorporación de un H2A.Z esencial en la posición +1 en prácticamente todos los eucariotas (30) sugiere que sus propiedades físicas específicas pueden cumplir un papel también en el alargamiento transcripcional, y que el uso de la movilidad de los nucleosomas para la regulación es general y mecanismo evolutivamente conservado.


¿Cuál es el mecanismo de intercambio de histonas durante la transcripción?

Está claro a partir de la evidencia discutida anteriormente que el intercambio de dímeros H2A / H2B (eliminación del ADN y reemplazo con H2A / H2B nuevo) es más frecuente y más rápido que el intercambio H3 / H4 durante la transcripción. No está claro si esto se debe al retorno preferencial de las proteínas H3 / H4 originales al ADN en lugar de ser reemplazadas por nuevas H3 / H4, o si la ruptura simultánea de todas las interacciones ADN-H3 / H4 (que se requiere para desalojo de histonas) ocurre con menos frecuencia que para el


La deposición de variantes independiente de la replicación marca el panorama de la cromatina

H2A.Z altera las propiedades de los nucleosomas

Las variantes de H2A son las más diversas, tal vez reflejen una restricción estructural relajada dentro del nucleosoma. Una de esas variantes, H2A.Z, surgió una vez temprano en la evolución eucariota y se ha mantenido distinta de H2A desde entonces (Talbert y Henikoff 2010). A nivel de aminoácidos, H2A.Z es sólo un 60% idéntico al H2A dentro de las especies, pero está relativamente conservado entre especies y es esencial en los metazoos (Zlatanova y Thakar 2008). Sorprendentemente, la estructura del nucleosoma H2A.Z es bastante similar a H2A, sin embargo, existen diferencias estructurales clave (Suto et al. 2000). En la superficie, H2A.Z tiene un parche ácido extendido, que estimula la actividad remodeladora con el remodelador ISWI ATP dependiente (Goldman et al. 2010). Dentro del núcleo, el bucle L1 es estructuralmente distinto, y en el dominio de acoplamiento con H3 / H4, una sustitución de glutamina por glicina en H2A.Z compromete tres enlaces de hidrógeno, que se prevé que debilitarán la interacción. A pesar de estas diferencias estructurales, el cambio en la estabilidad de la partícula es sutil, con resultados contrastantes reportados. En general, el consenso es que H2A.Z se estabiliza ligeramente in vitro y se desestabiliza in vivo (Zlatanova y Thakar 2008 Bonisch y Hake 2012). Esta discrepancia podría atribuirse a modificaciones postraduccionales in vivo, donde H2A.Z se acetila en genes activos (Bruce et al.2005 Valdes-Mora et al.2012) diferencias en la secuencia de ADN o al hecho de que los nucleosomas H2A.Z pueden ser híbrido in vivo, ya sea heterotípico (Z / A) u homotípico (Z / Z) (Viens et al. 2006 Luk et al. 2010 Weber et al. 2010).

Deposición de H2A.Z y un ciclo inútil

En la levadura, H2A.Z puede unirse a la chaperona general H2A / H2B, Nap1 o Chz1, que se unen preferentemente a H2A.Z sobre H2A (Luk et al. 2007). Estos acompañantes proporcionan una fuente de H2A.Z para el complejo de remodelación Swr1, que intercambia H2A.Z por H2A (Mizuguchi et al. 2004). Algunos metazoos contienen dos ortólogos Swr1 que se organizan en al menos dos complejos distintos, P400 / TIP60 y SRCAP, que, como Swr1, catalizan la reacción de intercambio. Si bien estos complejos comparten algunos componentes, existen muchas diferencias (Billon y Cote 2012). Por ejemplo, un acompañante humano específico de H2A.Z, ANP32E, se caracterizó recientemente como parte de P400 / TIP60 pero no del complejo SRCAP (Obri et al. 2014). Curiosamente, la familia ANP32 tiene muchos miembros de función no caracterizada, donde al menos otro, ANP32B, ha demostrado ser un acompañante de H3 / H4 (Tochio et al. 2010). Es probable que queden por descubrir muchas otras histonas chaperonas.

H2A.Z comprende aproximadamente el 15% del H2A total y se distribuye por todo el genoma de forma no aleatoria tanto en eucromatina como en heterocromatina, donde está monoubiquitinado (Sarcinella et al.2007), sin embargo, no ha quedado claro cómo se enriquece H2A.Z en sitios particulares en el genoma. El chip de alta resolución (inmunoprecipitación de cromatina) y la bioquímica del complejo Swr1 de levadura revelaron que Swr1 actúa preferentemente en regiones empobrecidas en nucleosomas (NDR) que tienen & gt50-70 pb y requieren que la subunidad Swc2 se una al ADN (Ranjan et al. 2013 Yen et al. al.2013). Los NDR están ubicados predominantemente en la región promotora de genes activos y se caracterizan por dos nucleosomas flanqueantes bien posicionados. Se requieren ciertos factores de transcripción y remodeladores de cromatina para el establecimiento y mantenimiento de NDR, pero H2A.Z y Swr1 son prescindibles (Whitehouse et al. 2007 Hartley y Madhani 2009). Mientras que el reclutamiento al NDR podría ser suficiente para explicar el enriquecimiento de H2A.Z en los nucleosomas que flanquean a los promotores, H2A.Z también se enriquece en cierta medida en los cuerpos génicos de todos los eucariotas estudiados. Además, el reclutamiento de NDR no explica cómo algunos organismos, incluidos Arabidopsis (Zilberman et al.2008) y Drosophila (Mavrich et al. 2008), carecen de nucleosomas H2A.Z corriente arriba (Fig. 2A).

(A, cima) El ciclo inútil de H2A.Z de deposición por Swr1 o complejos ortólogos y luego eliminación por Ino80, Anp32E o Swr1 cuando H3K56 está acetilado. (Fondo) Patrones de enriquecimiento H2A.Z y diferencias en la arquitectura del promotor en diferentes organismos. (B) macroH2A se deposita en los genes inactivos X (Xi) e inactivos / activos en los autosomas. (C) La deposición de H3.3 está mediada por el complejo HIRA en los genes y elementos reguladores, mientras que Atrx y Daxx median la incorporación de H3.3 en los telómeros y la heterocromatina pericéntrica. No está claro cómo se enriquece H3.3 en algunos cis-Elementos regulatorios.

En los metazoos, el enriquecimiento de H2A.Z se correlaciona con el nivel de expresión. Una posibilidad atractiva es que la pérdida de dímero seguida de la sustitución con H2A.Z contribuya a los patrones de enriquecimiento génico y a la incorporación de bajo nivel en todo el genoma. En apoyo de esta posibilidad, los nucleosomas homotípicos Z / Z se enriquecen con genes activos (Weber et al.2010 Nekrasov et al.2012), lo que podría ser el resultado de la pérdida de dímero mediada por la transcripción y luego el reemplazo oportunista con H2A.Z, que se produce a lo largo del ciclo celular. De acuerdo con el reemplazo acoplado a la transcripción, la presencia de nucleosomas H2A.Z en sentido ascendente que se observan en algunos organismos se correlaciona con la transcripción bidireccional en levaduras y mamíferos (Core et al.2008 Xu et al.2009), mientras que el enriquecimiento de H2A.Z en sentido ascendente no se observa en Arabidopsis y Drosophila. La metilación del ADN y H2A.Z están anti-correlacionados en plantas y animales (Conerly et al.2010 Zemach et al.2010), y en Arabidopsis, existe un antagonismo mutuo (Zilberman et al. 2008), lo que sugiere que los factores epigenéticos también contribuyen a la localización de H2A.Z.

En células de mamíferos, la localización preferencial de H2A.Z también se observa en un subconjunto de promotores de genes asociados con la unión del factor de transcripción (Gevry et al. 2007 Gallant-Behm et al. 2012). Además, el trabajo en células madre embrionarias (ESC) ha demostrado que H2A.Z se localiza preferentemente en los promotores de genes silenciosos ocupados por el complejo represivo Polycomb 2 (PRC2) (Creyghton et al. 2008 Illingworth et al. 2012). H2A.Z también está enriquecido en potenciadores en ESC y facilita la unión de modificaciones de PRC2 y H3K4me3 y H3K27me3 (Hu et al. 2013). También en los ESC, H2A.Z aumenta la accesibilidad de los nucleosomas en los sitios de unión de FoxA2 (Li et al. 2012) y la accesibilidad del factor de transcripción (Hu et al. 2013). A pesar de estas intrigantes observaciones, no está claro cómo se enriquece H2A.Z en las regiones reguladas por el desarrollo.

H2AZ se puede eliminar activamente de la cromatina. Por ejemplo, la chaperona ANP32E descrita recientemente elimina específicamente H2A.Z de los nucleosomas, incluidos los de cis-sitios reguladores (Obri et al. 2014). El complejo Ino80 cataliza el reemplazo de H2A.Z con H2A canónico (Papamichos-Chronakis et al. 2011), justo lo contrario del complejo Swr1, completando así un ciclo inútil cuando ambos complejos actúan sucesivamente sobre el mismo nucleosoma. En un mutante Ino80, H2A.Z está mal localizado globalmente, lo que sugiere que Ino80 elimina H2A.Z que está incorporado de forma espuria.Ino80 también se encuentra en los NDR de levadura, donde ChIP de alta resolución sugiere que las subunidades Nhp10, les5 y Arp8 son importantes para la unión, similar a la subunidad Swc2 del complejo Swr1 (Yen et al. 2013). Además, Swr1 puede llevar a cabo la reacción inversa cuando H3K56 se acetila en levadura (Watanabe et al. 2013). Sin embargo, cuando Swc2 está presente, esta actividad se inhibe, lo que sugiere que esta subunidad funciona como un bloqueo para evitar una mayor remodelación. En la levadura, H3K56 se acetila durante el ensamblaje del nucleosoma acoplado a la replicación y está presente en ~ 30% de la histona H3 total (Xu et al. 2005), mientras que marca & lt1% en células humanas (Xie et al. 2009). Teniendo en cuenta su escasez de metazoos, no está claro qué papel general desempeña H3K56ac en la eliminación de H2A.Z.

Otras variantes de H2A: vida al límite

A diferencia de H2A.Z, que es casi universal en eucariotas, otras variantes de H2A independientes de la replicación implicadas en la transcripción han evolucionado solo en animales. Por ejemplo, H2A.B, descrito por primera vez como H2A.Bbd (Barr deficiente en el cuerpo) se ha encontrado solo en mamíferos. H2A.B es solo aproximadamente un 50% idéntico al H2A y está evolucionando rápidamente (Ishibashi et al. 2010). El extremo C de H2A.B es 19 aminoácidos más corto que el de H2A, lo que reduce la cola y parte del dominio de acoplamiento. H2A.B carece de un parche ácido en su superficie y también se conoce como H2A.Lap1 (carece del parche ácido 1) (Soboleva et al. 2012). Estas modificaciones de la estructura alteran sustancialmente las propiedades físicas de los nucleosomas que contienen H2A.B. Por ejemplo, las matrices de nucleosomas humanos H2A.B inhiben la formación de fibras compactas de cromatina (Zhou et al. 2007). El H2A.B de ratón puede formar matrices parcialmente compactadas debido a un solo residuo de aspartato en el parche ácido, que no se encuentra en humanos (Soboleva et al. 2012). De acuerdo con un papel integral del dominio de acoplamiento en la modulación de la estabilidad del nucleosoma, los nucleosomas H2A.B son menos estables, protegen ∼30 pb menos de ADN contra la digestión de nucleasas microcócicas e intercambian mucho más rápido mediante FRAP que el H2A canónico (Bao et al.2004 Gautier et al. al.2004 Doyen et al.2006b Bonisch y Hake 2012 Tolstorukov et al.2012). Estos efectos se pueden atribuir en gran medida al dominio de acoplamiento porque la adición de la cola C-terminal H2A, incluido el dominio de acoplamiento, en H2A.B revierte parcialmente la inestabilidad (Doyen et al. 2006b).

Actualmente, no está claro si existen acompañantes o mecanismos específicos para la deposición de H2A.B. Sin embargo, el acompañante general NAP-1 puede ensamblar y desensamblar eficientemente los dímeros H2A.B in vitro (Okuwaki et al. 2005). En las células HeLa, el H2A.B expresado ectópicamente se localiza sobre los cuerpos de los genes y se correlaciona con el nivel de expresión (Tolstorukov et al. 2012). De manera similar, en las ESC, el H2A.B endógeno se enriquece sobre el cuerpo de genes transcritos activamente (Chen et al. 2014). Por el contrario, en los testículos de los ratones, donde el H2A.B es especialmente abundante, se enriquece con respecto a los promotores de genes y poco a los cuerpos de los genes (Soboleva et al. 2012). No está claro por qué la localización de H2A.B es diferente; sin embargo, la deposición de H2A.B da como resultado un paisaje de cromatina distinto que está desestabilizado y menos compacto.

Otra variante de H2A implicada en la transcripción, la macroH2A, es distinta de todas las demás histonas en que contiene un dominio globular (macro) no histona. El macrodominio en el terminal C está conectado a través de un enlazador no estructurado a un dominio de pliegue de histona que es aproximadamente un 60% idéntico al H2A canónico, lo que da como resultado una proteína de histona que es aproximadamente tres veces el tamaño de H2A (Chakravarthy et al. 2005). Las proteínas que contienen macrodominios se encuentran en muchos organismos; sin embargo, el macroH2A está restringido a vertebrados y algunos invertebrados (Talbert y Henikoff 2010). Se sabe que los macrodominios se unen a metabolitos de NAD +, incluida la poli (ADP-ribosa), y tienen funciones biológicas distintas, incluida la regulación transcripcional (Han et al. 2011). En los vertebrados, hay tres isoformas macroH2A: macroH2A.1.1, macroH2A.1.2 y macroH2A.2. Los dos primeros son isoformas de corte y empalme de un solo gen, mientras que un gen separado codifica el último. Sin embargo, solo macroH2A.1.1 es capaz de unirse a metabolitos de NAD +. A diferencia de H2A.Z y H2A.B, el macroH2A forma preferentemente nucleosomas heterotípicos in vitro, mientras que H2A.Z no muestra ninguna preferencia (Chakravarthy et al. 2004 Chakravarthy y Luger 2006). macroH2A tiene una mayor estabilidad dependiente de la sal que H2A, donde cuatro cambios de residuos en el bucle L1 son los más importantes (Abbott et al. 2005 Chakravarthy y Luger 2006).

In vivo, macroH2A se enriquece en el cromosoma X femenino inactivado transcripcionalmente, focos heterocromáticos asociados a la senescencia (SAHF) y grandes dominios transcripcionalmente silenciosos (Costanzi y Pehrson 1998 Zhang et al. 2005 Gamble et al. 2010 Tolstorukov et al. 2012). La localización de macroH2A en el X inactivo se interrumpe cuando se elimina el ARN de Xist, lo que sugiere un papel para este componente esencial. cis-ARN regulador en el reclutamiento de macroH2A (Csankovszki et al. 1999). Tanto los segmentos de histonas como los de no histonas de macroH2A son suficientes para apuntar al X inactivo (Chadwick et al. 2001 Nusinow et al. 2007). En SAHF, la deposición de macroH2A es promovida por el regulador de histona A (HIRA), un acompañante responsable de la incorporación de la variante de histona H3.3 en los genes, y el factor de ensamblaje y desensamblaje de nucleosomas Asf1 (Zhang et al. 2005). En lugar de depositar directamente macroH2A, estos acompañantes podrían ayudar a despejar el camino para la deposición de macroH2A. De acuerdo con una mayor estabilidad y un papel generalmente represivo, el macroH2A parece alterar la unión del factor de transcripción y se ha sugerido que perjudica la remodelación por SWI / SNF e ISWI (Angelov et al. 2003). Aunque los resultados más recientes sugieren que el macroH2A es un sustrato excelente para la remodelación por estos remodeladores, el macroH2A reduce el reclutamiento del remodelador SWI / SNF (Chang et al. 2008). macroH2A también se asocia con la translocasa de ADN de la familia SWI / SNF ATRX (α-talasemia / MR, ligada a X), que, como Ino80 para H2A.Z, regula negativamente la deposición de macroH2A (Fig. 2B Ratnakumar et al. 2012). A pesar de la identificación de estos socios para macroH2A, no está claro cómo se localiza en regiones genómicas específicas.

H3.3: llenar vacíos y más

Cuando un nucleosoma se pierde independientemente de la replicación, el (H3 / H4)2 tetrámero es reemplazado por la variante H3.3 y su socio H4. La mayoría de los eucariotas expresan el H3 canónico para la deposición acoplada a la replicación y la variante H3.3 independiente de la replicación; sin embargo, algunos eucariotas, como los hongos, expresan solo el tipo H3.3 (Malik y Henikoff 2003). En los metazoos, H3.3 se diferencia de H3 en solo cuatro o cinco aminoácidos (Filipescu et al. 2013). Tres de estas diferencias se encuentran dentro del dominio de pliegues de histonas centrales y especifican las vías de depósito alternativas (Ahmad y Henikoff 2002). La fracción del genoma ocupada por H3.3 es variable, dependiendo en gran medida de la dilución por H3 canónico durante la replicación. Por ejemplo, H3.3 comprende ~ 90% de la histona 3 en neuronas diferenciadas terminalmente (Pina y Suau 1987) sin embargo, en células en división, H3.3 comprende solo ~ 20% (McKittrick et al. 2004). La incorporación de H3.3 es en gran medida oportunista, y se produce cuando el ADN se expone en regiones dinámicas como los promotores de genes, el cuerpo de genes activos y cis-Elementos reguladores (Mito et al. 2007 Ray-Gallet et al. 2011 Schneiderman et al. 2012). También se encontró que H3.3 estaba enriquecido en un subconjunto de genes reprimidos en las ESC de mamíferos que exhiben una dinámica más baja, lo que sugiere un papel ampliado para H3.3 más allá de simplemente llenar los vacíos en la cromatina activa (Goldberg et al. 2010). El enriquecimiento de H3.3 sobre genes, tanto activos como inactivos, depende del complejo HIRA (Tagami et al. 2004). Además, se han descrito mecanismos independientes de HIRA de incorporación de H3.3 (Banaszynski et al. 2013). Por ejemplo, Daxx ha sido identificado como un nuevo acompañante específico de H3.3, que, junto con el remodelador de la familia SWI / SNF Atrx, es responsable de la incorporación en los telómeros y la heterocromatina pericéntrica (Drane et al. 2010 Goldberg et al. 2010). . Una sola sustitución de metionina por glicina en la posición 90 en H3.3 parece ser un contribuyente dominante a la especificidad de la interacción H3.3 con la chaperona Daxx (Elsasser et al. 2012). En Drosophila, Se ha demostrado que Daxx y Dek depositan H3.3 en elementos regulatorios (Sawatsubashi et al. 2010).

Desde una perspectiva estructural, H3 ocupa el centro del nucleosoma, por lo que no es sorprendente que la secuencia de una variante de H3 sea más restringida de lo que se ve para las variantes de H2A. Sin embargo, esta restricción no se observa en la variante cenH3 de H3 específica del centrómero, que comparte solo ∼50% -60% de identidad con H3 dentro del dominio de pliegues de histonas (Malik y Henikoff 2003). Teniendo en cuenta que las alteraciones de H3.3 son sutiles, no es sorprendente que no se haya detectado ninguna desestabilización atribuible a los nucleosomas de H3.3 in vitro (Thakar et al. 2009 Chen et al. 2013). Sin embargo, el análisis de la cromatina de las células de pollo encontró que los nucleosomas que contienen H3.3 son más sensibles a la alteración dependiente de la sal y que los nucleosomas de doble variante H3.3 / H2A.Z eran más inestables (Jin y Felsenfeld 2007). Este efecto fue independiente de la acetilación, una modificación asociada con la desestabilización de nucleosomas, lo que sugiere que el efecto es intrínseco o se debe a la incorporación en regiones activas del genoma. En apoyo de la última explicación, los nucleosomas H3.3 / H2A.Z están enriquecidos con respecto a los elementos reguladores y NDR, que con frecuencia se alteran (Jin et al. 2009). Sin embargo, el recambio de nucleosomas y la unión de HIRA a la cromatina se reducen después del agotamiento de H3.3 (Banaszynski et al. 2013). Recientemente se demostró que HIRA interactúa directamente con factores de transcripción y el complejo remodelador de cromatina Brg1 (Pchelintsev et al. 2013). Estos resultados en general sugieren que la incorporación de H3.3 promueve un estado hiperdinámico a través de sus compañeros de interacción dentro del núcleo.


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Conflicto de intereses

Los autores declaran que no existen intereses en competencia.

Contribuciones de autor

PM, Concepción y diseño, Adquisición de datos, Análisis e interpretación de datos.

JA, Adquisición de datos, Análisis e interpretación de datos.

VM, Adquisición de datos, Análisis e interpretación de datos.

SI, Adquisición de datos, Análisis e interpretación de datos.

CM, Adquisición de datos, Análisis e interpretación de datos.

LQ, Adquisición de datos, Análisis e interpretación de datos.

CY-S, Concepción y diseño, Análisis e interpretación de datos, Redacción o revisión del artículo.

DH, Concepción y diseño, Análisis e interpretación de datos, Redacción o revisión del artículo.

EH, Concepción y diseño, Análisis e interpretación de datos, Contribución de datos esenciales o reactivos inéditos.

FA, Concepción y diseño, Análisis e interpretación de datos.


MATERIALES Y MÉTODOS

Modelo de cinética de nucleosomas durante la replicación

Aquí presentamos un modelo para estudiar la reorganización de nucleosomas después de la replicación de genes. En este modelo, comenzamos considerando una cromatina inicial (parental) (ADN unido a nucleosomas) que tiene una organización de nucleosomas específica. El ADN se considera como una red unidimensional con cada par de bases marcado con un índice. I. El nucleosoma se modela como una partícula de núcleo duro que se sienta en la red, ocupando un espacio de k = 150 sitios de celosía (ver Figura 1). A t = 0, el replisoma comienza el proceso de replicación desde el origen de replicación (I = 0), y se mueve con una tarifa mínima | $ v $ | r (velocidad de movimiento de la horquilla sin obstáculos de nucleosomas) en la dirección de avance. A medida que el replisoma avanza, puede encontrar un nucleosoma. Dado que el nucleosoma es un complejo estable, puede haber retrasos en la progresión de la bifurcación a medida que las enzimas de remodelación intentan desensamblar el nucleosoma por delante de la bifurcación. Este retraso en la progresión de la bifurcación se denominará un evento de "pausa". Esta es una pausa en la progresión de la bifurcación y no en otros procesos. Consideramos τpag como la escala de tiempo típica de este evento de pausa (33, 35). En otras palabras, 1 / τpag es la tasa de expulsión de nucleosomas en la bifurcación de replicación. El replisoma, a medida que se mueve, crea un nuevo ADN bicatenario (dsDNA) detrás de él siempre que la longitud del dsDNA recién sintetizado sea mayor que el tamaño de un nucleosoma (& gt150 pb), un nuevo nucleosoma puede ocupar ese espacio con una tasa intrínseca de ksobre. La tasa de unión efectiva del nucleosoma es proporcional al espacio disponible libremente (ℓF) en el dsDNA para que los nucleosomas se unan, es decir, | $ k _ < rm on> ^ < rm eff> = k _ < rm on> times ell _f $ | (consulte la Información de apoyo (SI)). A medida que el replisome avanza, el proceso se repite. En este punto, es importante señalar que, como se mencionó anteriormente, experimentos recientes han indicado que la deposición de nucleosomas detrás de la bifurcación ocurre poco después del movimiento de la bifurcación (22, 25, 27) y es crucial para una replicación eficiente (27).

Diagrama esquemático que representa nuestro modelo para la dinámica de ensamblaje / desmontaje de nucleosomas durante la replicación. El complejo replisome (pentágono rojo) en la bifurcación se mueve con una velocidad | $ v $ | r en la dirección que muestra la flecha. Cuando se encuentra con un nucleosoma (óvalo azul) adelante, el movimiento de la horquilla se detiene durante un tiempo τpag que es la escala de tiempo para que el nucleosoma obstructor se desmonte (tasa de desmontaje = 1 / τpag). Cuando se produce una longitud suficiente de ADN de doble hebra (≥150 pb), se ensambla un nucleosoma detrás de la horquilla con una tasa intrínseca ksobre, y los nucleosomas recién ensamblados se deslizarán durante un período de tiempo de τs a un paso rs. El deslizamiento ocurre de tal manera que el nucleosoma se deslizará hasta la mitad de la región libre disponible.

Diagrama esquemático que representa nuestro modelo para la dinámica de ensamblaje / desmontaje de nucleosomas durante la replicación. El complejo replisome (pentágono rojo) en la bifurcación se mueve con una velocidad | $ v $ | r en la dirección que muestra la flecha. Cuando se encuentra con un nucleosoma (óvalo azul) adelante, el movimiento de la horquilla se detiene durante un tiempo τpag que es la escala de tiempo para que el nucleosoma obstructor se desmonte (tasa de desmontaje = 1 / τpag). Cuando se produce una longitud suficiente de ADN de doble hebra (≥150 pb), se ensambla un nucleosoma detrás de la horquilla con una tasa intrínseca ksobre, y los nucleosomas recién ensamblados se deslizarán durante un período de tiempo de τs a un paso rs. El deslizamiento ocurre de tal manera que el nucleosoma se deslizará hasta la mitad de la región libre disponible.

También se ha demostrado que los nucleosomas recién depositados se deslizan / reposicionan con la ayuda de remodeladores de cromatina dependientes de ATP apropiados, y esto es crucial para la formación del posicionamiento apropiado de los nucleosomas (30). En el modelo, siguiendo las señales de experimentos recientes (18, 19), asumimos que un nucleosoma se desliza hacia adelante y hacia atrás hasta que se asienta en el medio del dsDNA libre disponible. Para lograr este reposicionamiento, hacemos el siguiente ejercicio: cada nucleosoma tiene una tasa de deslizamiento dada por rs = rs0|(II0) | hacia la posición media I0, desde la ubicación actual I, con un paso de tamaño 10 pb. Aquí, rs0 es la tasa intrínseca de deslizamiento y I0 es la posición media del dsDNA libre (enlazador) disponible localmente en ese instante I0 evolucionará a medida que se desplaza el nucleosoma más cercano o la bifurcación. Sin embargo, el nucleosoma no se desliza para siempre, deja de deslizarse después de un tiempo τs. El deslizamiento podría detenerse porque la ATPase que facilita el deslizamiento puede desmontarse o dejar de funcionar después de cierto tiempo τs.

Lo que se da arriba es nuestro modelo básico que describe la dinámica de ensamblaje de nucleosomas. Sin embargo, también hemos ampliado el modelo para introducir la unión de proteínas que no son histonas, como los factores reguladores de genes (GRF) o proteínas que se unen cerca de los orígenes de replicación. Estas proteínas se consideran partículas que interactúan estéricamente como un nucleosoma, pero con diferentes tamaños y diferentes valores de parámetros. Por ejemplo, los GRF tendrán un tamaño menor que un nucleosoma, mientras que su tasa de deslizamiento será cero. Utilizando la misma configuración de simulación que hemos desarrollado aquí, investigamos el papel de diferentes factores proteicos no histonas y cómo afectan a la organización del nucleosoma después de la replicación.

Parámetros y sus valores numéricos

Hay cinco parámetros (tarifas o escalas de tiempo) en el modelo. Sin embargo, muchos de ellos están limitados por datos experimentales conocidos. La tasa básica de replicación (⁠ | $ v $ | r) y la escala de tiempo de pausa de la bifurcación de replicación están limitados por el tiempo que lleva completar la replicación en un tramo. Estas velocidades se toman de tal manera que se replican 1,5-2 kb de dsDNA en un minuto (33). De manera similar, la densidad del nucleosoma del padre limita la tasa de deposición del nucleosoma y la velocidad de la bifurcación. En nuestras simulaciones hemos utilizado un rango de densidad de nucleosomas de 60 a 90% como se conoce en vivo (4, 8). Aparte de las restricciones anteriores, varios experimentos publicados en la literatura también nos dan rangos relevantes de valores de parámetros. La tasa de movimiento hacia adelante de la horquilla de replicación se estima en el rango de 10 a 500 pb / s (36). La tasa de unión de los nucleosomas (ksobre) se estima en ≈0,1−10 (pb s) −1 (20, 37). La horquilla pausando la escala de tiempo, τpag, que ocurre debido al retraso en el desmontaje del nucleosoma antes de la bifurcación, se puede estimar en muchos segundos / decenas de segundos (20, 33, 37). Esto también es comparable a la escala de tiempo conocida de pausas similares durante la transcripción (38, 39). En (33), la escala de tiempo de desmontaje de nucleosomas antes de la bifurcación de replicación (la escala de tiempo de pausa) se estima en 7 s, asumiendo una tasa de desmontaje uniforme en todas partes. Sin embargo, habrá heterogeneidad (debido a la secuencia de ADN / estabilidad del nucleosoma) y puede variar en un rango de ~ 7 s dependiendo de la ubicación / tipo de célula. Por lo tanto, hemos realizado nuestras simulaciones para una amplia gama de τpag valores. No conocemos los parámetros de deslizamiento con precisión. Por lo tanto, en este trabajo variamos el parámetro de duración de deslizamiento (τs) en una amplia gama y examine cómo afectaría esto a la organización de los nucleosomas durante la replicación. El otro parámetro deslizante rs0 también varía de 0,05 a 1 pb −1 s −1.

Detalles de la simulación

En este trabajo, dados los eventos y tasas, simulamos el sistema utilizando métodos cinéticos de Monte Carlo (algoritmo de Gillespie) (40). Partimos de un perfil de nucleosoma parental específico (patrón de ocupación) y simulamos la replicación, según los eventos discutidos anteriormente, y producimos una organización de nucleosomas en la cromatina hija. Repetimos esto muchas veces (normalmente 5000) y calculamos la ocupación media de nucleosomas en las células hijas. Ocupación en cualquier posición I se define como la probabilidad de que el sitio esté cubierto por un nucleosoma. Las tasas utilizadas para cada figura se dan en el texto.


Expresiones de gratitud

Agradecemos a John Widom por los plásmidos que contienen las secuencias de posicionamiento del nucleosoma David Clark, Mark Gartenberg y Don Luse por las sugerencias y la lectura crítica del manuscrito y al Centro de Supercomputación de la Universidad Estatal de Moscú Lomonosov por utilizar las instalaciones computacionales (61). Los estudios que utilizaron materiales marcados radiactivamente fueron apoyados en parte por NIH Grant GM58650 (a V.M.S.). Los estudios de microscopía de partículas individuales fueron apoyados por la Russian Science Foundation (RSF 14-24-00031).


Ver el vídeo: nucleosoma (Mayo 2022).