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Retraso de la PCR en tiempo real en Cq debido a la inserción de SNP en el cebador

Retraso de la PCR en tiempo real en Cq debido a la inserción de SNP en el cebador


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Estoy recopilando evidencia, incluso anecdótica, de cómo la deleción o inserción de un solo nucleótido en la región del cebador afecta el resultado de la PCR en tiempo real. Lo que más me interesa es cuánto hay un retraso en Cq (valor del ciclo de umbral) en comparación con la imprimación perfectamente combinada. Pero si no tiene datos de Cq, también recopilo respuestas "Sí o No", diciendo si hubo amplificación o no.

Me interesan específicamente las discrepancias de inserción o eliminación. (Para los desajustes de sustitución, hay muchos datos).

Agradeceré cualquier evidencia publicada o no publicada.


Como señaló @WYSIWYG, tener la diferencia de indel en el extremo 3 'puede ser informativo, pero me está costando más encontrar pruebas en medio de la cartilla. Poner la mutación / indel en el extremo 3 'cambiará el ΔCT. Para hacerlo bien, necesita una amplia cobertura en su sitio de mutación.

Creo que es posible que pueda haber una diferencia con un desajuste en el medio de una cartilla, pero no sería tan obvio como si estuviera más cerca del extremo 3 '. A menos que haya alguna razón seria por la que no pueda ponerlo allí (es decir, Tm por debajo de 45 en la referencia), eso suena como un diseño de imprimación deficiente.

Notaré que ciertamente no soy un experto en qPCR, y no creo que la pregunta haya sido investigada directamente (como supusiste). De nuevo, cuando busqué Indels antes (estaba haciendo algunas cosas interesantes con tipos HLA…) usamos cebadores más grandes para la qPCR.

Si esto no responde satisfactoriamente a su pregunta, ¿hay alguna referencia inicial que quisiera que analicemos? Me imagino que cosas como una buena extinción y otros factores podrían sacar algo de importancia al comparar dos plantillas (una con indel y otra sin), pero nuevamente, es un poco extraño poner la mutación en el medio.

Edite los comentarios: 1: Creo que el retraso de Cq dependerá de cosas como la longitud, la secuencia y la mutación. Puede haber una fórmula / algoritmo de gran esquema para predecir el retraso, pero no conozco ninguno, y no podría encontrarlo si existe. La mayoría de los gráficos y las diferencias que he visto han sido lo suficientemente grandes como para convencerme de que eran importantes. No sé si esto es como un flujo donde puedes sentarte y discutir todo el día sobre la relevancia biológica del 40% al 30% de un grupo en particular.

2: Lo siento, no tuve tiempo de entrar y darles un resumen adecuado. Son, como señaló, tangenciales a lo que está tratando de hacer, pero de hecho abordan el problema a través de sus métodos. Intentaré un verano mejor cuando tenga tiempo (tengo una subvención y estoy tratando de terminar el martes, así que probablemente después de eso). Si desea agregar alguna aclaración a la pregunta, hágalo.

3: Esto puede haber surgido de la percepción general de que era necesario y de que apunto a la Tm más alta que puedo manejar en general sin que se introduzcan problemas de estructura. También tengo el lujo de no tener que preocuparme por el costo de los ulta-mers. También podría provenir de la historia de trabajo en BAC hace años. Los cebadores más largos siempre aumentaban mis tasas de éxito cuando estaba eliminando casetes.


Genotipado colorimétrico de un solo paso del polimorfismo de un solo nucleótido mediante amplificación isotérmica mediada por bucle mejorada con sonda (PE-LAMP)

1. Centro de Investigación de Productos Naturales, Instituto de Biología de Chengdu, Academia de Ciencias de China, Chengdu 610041, P. R. China
2. Universidad de la Academia de Ciencias de China, Beijing 100049, P. R. China
3. Universidad de Medicina Tradicional China de Chengdu, Chengdu 611137, P. R. China.

Citación:
Ding S, Chen R, Chen G, Li M, Wang J, Zou J, Du F, Dong J, Cui X, Huang X, Deng Y, Tang Z. Genotipado colorimétrico de un solo paso del polimorfismo de un solo nucleótido utilizando un bucle mejorado con sonda amplificación isotérmica mediada (PE-LAMP). Teranósticos 2019 9 (13): 3723-3731. doi: 10.7150 / thno.33980. Disponible en https://www.thno.org/v09p3723.htm


Fondo

Melón (Cucumis melo L., 2n = 24) es un cultivo económico muy importante con una variación fenotípica diversa en la fruta, y se cultiva a nivel mundial con un rendimiento de más de 32 millones de toneladas producidas en 2017 (FAOSTAT http://faostat.fao.org). El valor de mercado del melón está influenciado por la calidad de la fruta en términos de tamaño, forma, color de la pulpa, color de la piel y sabor, que está determinado principalmente por el contenido de azúcar, la acidez y el perfil aromático [1, 2, 3]. Según la pubescencia del ovario, el melón se clasificó en dos subespecies, Cucumis melo ssp. melo y Cucumis melo ssp. agrestis, y luego dividido en 16 grupos hortícolas de acuerdo con las variaciones morfológicas de la fruta [1]. C. melo ssp. melo se cultiva en todo el mundo, mientras que C. melo ssp. agrestis se concentra en el este de Asia.

Un paso clave para detectar QTL y realizar el mapeo de genes es la construcción de un mapa genético confiable. En el pasado, se construyeron varios mapas de ligamiento genético de diferentes poblaciones utilizando un número muy limitado de marcadores como repeticiones de secuencia simple (SSR), polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados (AFLP) y ADN polimórfico amplificado aleatoriamente (RAPD) [4,5,6 , 7,8]. Estos mapas se utilizaron principalmente para detectar QTL en busca de resistencia a enfermedades y rasgos agronómicos [9,10,11,12]. El genoma del melón se lanzó en 2012 [13] y se mejoró significativamente sobre la base de un mapa genético de alta resolución, que empleó 580 polimorfismos de nucleótido único (SNP) que anclaban secuencias de 354,8 Mb [14]. Esto sentó las bases de mapas de alta resolución en melón. Para integrar la información de investigaciones anteriores en el genoma del borrador del melón, se mapearon 836 marcadores genéticos, incluidos los SSR y los SNP del mapa de consenso, en el genoma mejorado del melón [15]. En particular, el rápido avance en la secuenciación de próxima generación hizo posible el uso de marcadores SNP y un genotipado más preciso para construir mapas genéticos de densidad ultra alta. Los hallazgos recientes de eventos de domesticación independiente en melón sugirieron que el descubrimiento de SNP en diversos grupos botánicos de melón avanzará en nuestra comprensión de los mecanismos genéticos de diversificación y domesticación, como se muestra en varios estudios [14, 15, 16, 17]. Se construyeron mapas genéticos con marcadores SNP mediante genotipificación por secuenciación (GBS) y RNA-Seq para identificar los QTL que controlan la calidad de la fruta [18, 19]. Sin embargo, el mapa genético de alta densidad basado en la resecuenciación del genoma completo adecuado para el análisis QTL de los rasgos de domesticación no está disponible hasta la fecha. El tamaño del fruto es uno de los rasgos de domesticación y diferenciación más importantes del melón. En el melón sólo se han descrito unos pocos genes conocidos asociados con el tamaño de la fruta [16], aunque se han identificado algunos genes de resistencia a enfermedades [20, 21], monoecia de la fruta [22, 23], color de la pulpa y color de la cáscara [24, 25].

La resecuenciación del genoma completo (WGR) es un enfoque muy útil para la construcción de mapas genéticos y el mapeo fino de genes. Según nuestra investigación anterior, las dos subespecies (agrestis y melo) fueron domesticados de forma independiente y tienen una fuerte diferenciación poblacional [16]. Entonces, construimos dos F2 mapeo de poblaciones derivadas de los cruces "JL475" × "YS474" (cultivado agrestis × salvaje agrestis, WAP para análisis de domesticación) y "HG118" × "SD119" (cultivado melo × cultivado agrestis, MAP para análisis de diferenciación). El objetivo de este estudio fue construir mapas genéticos de alta densidad utilizando WGR y explorar QTL en el proceso de domesticación y diferenciación del melón. Estos mapas genéticos ayudarán a futuros programas de mejoramiento al facilitar el diseño de la selección de melón asistida por marcadores.


Introducción

La hematología moderna utiliza en gran medida métodos moleculares para el diagnóstico y la selección de tratamientos. En este artículo, nos centramos en la genotipificación de antígenos menores de histocompatibilidad (MiHA) (Griffioen et al., 2016). Los MiHA son péptidos polimórficos, después del trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT) pueden inducir una respuesta inmune si el donante y el receptor no coinciden para los polimorfismos codificantes de MiHA (de Bueger et al., 1992). En una condición particular, estos péptidos podrían convertir las células receptoras en extrañas para las células inmunes del donante y causar consecuencias perjudiciales & # x2013 reacción inmunitaria sistémica hacia las células del paciente (Shlomchik, 2007). Si una expresión de MiHA se limita al tejido hematopoyético, la MiHA aún hace que las células hematopoyéticas del huésped sean extrañas para el injerto, pero esto conduciría a la eliminación del clon de células patógenas residuales, ya que también es de origen hematopoyético (Falkenburg y Warren, 2011). Además, el MiHA específico de tejido puede ser un objetivo para la terapia celular (Bleakley y Riddell, 2011). La mayoría de los MiHA se originan a partir de polimorfismos de un solo nucleótido no sinónimos (nsSNP), que cambian la secuencia de aminoácidos de las proteínas. La genotipificación de MiHA nos permite predecir las consecuencias del TCMH y estudiar los objetivos plausibles para la terapia celular.

La mayoría de las MiHA están codificadas por nsSNP y podrían genotiparse mediante un vasto arsenal de métodos de genotipado de SNP, como la PCR de alelos específicos (AS-PCR), el análisis del polimorfismo de longitud de los fragmentos de restricción (RFLP), la PCR de fusión de alta resolución (HRM-PCR) , qPCR con balizas fluorescentes o sondas de hidrólisis fluorescentes, extensión de un solo nucleótido, secuenciación de ADN y microarrays.

AS-PCR es una PCR con un cebador universal y un par de cebadores específicos de alelo (ASP), cuyo extremo 3 & # x2032 es complementario a cada alelo SNP (Ugozzoli y Wallace, 1991). Para determinar un genotipo de SNP, se necesitan dos reacciones de PCR independientes: una por alelo de SNP (Spierings et al., 2006). Análisis de RFLP basado en la digestión del producto de PCR que contiene SNP de interés por endonucleasa de restricción de tipo II que reconoce solo una de las variantes de SNP (Pierce et al., 2001). Ambos métodos requieren electroforesis en gel de agarosa para detectar el producto de la PCR o los fragmentos de restricción y realizar la llamada del alelo. Estos dos métodos podrían multiplexarse ​​debido a la diferencia de longitud del producto, aunque complica la interpretación de los resultados. Por el contrario, los métodos de PCR en tiempo real, como HRM-PCR, qPCR con una baliza específica de alelo o una sonda de hidrólisis, podrían realizarse en un solo paso con poco tiempo práctico. El segundo conjunto de técnicas utiliza tintes fluorescentes para visualizar la acumulación de producto. La falta de un paso de posprocesamiento de PCR es una ventaja significativa, ya que reduce tanto el riesgo de contaminación como el tiempo de manipulación. HRM-PCR se basa en una medición precisa de la caída de fluorescencia mientras se funden amplicones cortos después de la PCR con un colorante intercalante. Los estados del SNP diferirán ligeramente en la temperatura de fusión y la velocidad de fusión. Las limitaciones del método son que requiere software propietario, es difícil de multiplexar, necesita reacciones de control cada vez, su sensibilidad depende del tipo de SNP y es propenso a inexactitudes (S & # x0142omka et al., 2017). La qPCR con baliza o sondas de hidrólisis utiliza oligonucleótidos conjugados con tintes fluorescentes y extintores, estas balizas o sondas son complementarias al sitio SNP. Para el genotipado de un SNP, se necesitan sondas separadas con diferentes tintes para cada alelo y el tipado se realiza en un tubo. Las sondas y balizas con diferentes fluoróforos permiten multiplexar reacciones, pero la mayoría de los kits de genotipado de SNP basados ​​en qPCR disponibles comercialmente están diseñados para genotipar un SNP por prueba, por lo que cada SNP requiere una prueba separada. Este método es el software de sistemas de detección de qPCR más común y capaz de realizar llamadas de alelos para el método. Entre la química necesaria para una qPCR, las sondas fluorescentes son las más caras, y hay dos de ellas en cada reacción de genotipado. Además, la unión de las sondas depende del alelo del SNP y del contexto del ADN.

La secuenciación de Sanger es el método más preciso, pero carece de posibilidad de multiplexación y se realiza en varios pasos, que pueden tardar hasta 1 día. La genotipificación de SNP podría ampliarse mediante una reacción de extensión de un solo nucleótido o incluso mediante secuenciación de próxima generación (NGS). Ambos últimos métodos toman mucho tiempo para realizarse, hasta varios días, pero permiten genotipar decenas a miles de SNP simultáneamente. Aunque es excesivo para la genotipificación de un pequeño conjunto de MiHA conocidos, podría usarse para el descubrimiento de nuevos MiHA (Kawase et al., 2008 Bergen et al., 2010). Las técnicas de genotipado de SNP se revisaron en Kim y Misra (2007). El genotipado de MiHA se revisó en Spierings y Goulmy (2007).

Como el número de MiHA clínicamente relevantes es actualmente inferior a cien, pero más de una docena, no es práctico utilizar un SNP por método de prueba o NGS y microarrays. Además, debido a que la presentación de MiHA está restringida por un alelo de HLA, tiene sentido desarrollar paneles de genotipificación agrupados por restricción de HLA. Algunos MiHA aparecen debido a indeles, por lo que el método de elección también debería ser capaz de genotipar indeles.

Elegimos la variación de AS-PCR realizada con sondas de hidrólisis en tiempo real (designadas de aquí en adelante como AS-qPCR) (Stadhouders et al., 2010). Nuestro objetivo era crear un método robusto, multiplex y económico, por lo que nos ceñimos a AS-qPCR como método de elección. Aunque tenemos que usar dos tubos para un SNP para separar dos reacciones específicas de alelos, podemos establecer tantas reacciones paralelas en un pozo como lo permita el sistema óptico de una máquina qPCR: cada objetivo está & # x201C codificado por colores & # x201D usando un específico de gen sonda de hidrólisis con un colorante fluorescente. La sonda es universal para ambos tubos. El resultado positivo de AS-qPCR para el alelo se juzga por el simple hecho de que la qPCR tenga éxito y un aumento en la señal de fluorescencia.

En el estudio anterior, desarrollamos nuestro AS-qPCR para, con mucho, el grupo restringido HLA-A & # x2217 02:01 más grande de los 20 MiHA conocidos (Romaniuk et al., 2019). El enfoque propuesto revela plena potencia, realizado en un múltiplex & # x2013 cuatro SNP se pueden genotipar utilizando dos pozos. Además, el conjunto de genotipado de ejemplo tiene una reacción de genes de control incorporada en cada pocillo. Muestra cualquier imprecisión de pipeteo y permite la normalización de la carga de ADN y la comparación de pozos sin repeticiones técnicas. Una prueba es para la deleción de genes y, en este caso, ambos tubos tienen la misma reacción específica de gen para el indel. Aunque nuestro método de genotipado MiHA propuesto es fácil de analizar mediante el enfoque & # x201Cvisual, & # x201D casi quinientos eventos posibles por análisis de renderizado de placa, que requiere mucho tiempo y es propenso a errores. Entonces, para acompañar la genotipificación, en este artículo, informamos AScall & # x2013 el programa para fomentar el análisis de datos por lotes para el método AS-qPCR. En el ejemplo, usamos los cinco canales de detección del sistema de detección de PCR en tiempo real CFX96 Touch (Bio-Rad, Estados Unidos): cuatro canales para polimorfismos diana y un canal para un gen de control. En el ejemplo, el kit AS-qPCR para 20 MiHA restringidos por HLA-A & # x2217 02, cuatrocientas reacciones se ejecutan en paralelo en una placa de 96 pocillos para ocho muestras de ADN: para un gen de control, 19 SNP y una deleción de gen. El rendimiento de nuestro programa se demostró utilizando 96 muestras de ADN genómico genotipadas con el método AS-qPCR para este conjunto de MiHA y se comparó con el genotipado manual. El software AScall permitió reducir el tiempo de análisis y mostró resultados comparables con los de genotipado manual.

Los sistemas de detección de qPCR se pueden encontrar en muchos laboratorios de biología molecular de diagnóstico y científicos, ya que qPCR es un método rápido y práctico para diversas aplicaciones. Entonces, como consecuencia obvia, existen muchas herramientas de software para el análisis de qPCR, particularmente para el genotipado de SNP. Según nuestro conocimiento, todas las herramientas de llamada de SNP para qPCR analizan los datos obtenidos mediante el enfoque & # x201Cone-tube & # x201D, un SNP se genotipa en un tubo utilizando dos específico de alelo sondas de hidrólisis con diferentes tintes fluorescentes, un SNP por pocillo. Un enfoque de este tipo implementado en el software CFX Manager mediante la trama de discriminación alélica. Además, estos programas no permiten un análisis más sofisticado con control de calidad para el experimento. El lenguaje R se usa ampliamente para procesar datos qPCR (R & # x00F6diger et al., 2015a Burdukiewicz et al., 2018). Sin embargo, las soluciones listas para usar, como Chainy (Mallona et al., 2017), no se corresponden con nuestra tarea específica. Un programa de llamada no se limita al panel de genotipado de ejemplo, sino que se puede aplicar fácilmente a conjuntos de cebadores diseñados en consecuencia y a cualquier número de reacciones por pocillo.


RESULTADOS

C. burnetii PCR en tiempo real.

Detectar C. burnetii, se diseñó una nueva PCR cuantitativa en tiempo real que se dirige al elemento de inserción IS1111. La presencia de este elemento en múltiples copias (7 a 120 copias) de la C. burnetii El genoma asegura la detección sensible de la bacteria (6). Diluciones diez veces mayores de ADN del C. burnetii La cepa Nine Mile mostró una detección lineal de 3 a 3 & # x000d7 10 6 equivalentes de genoma (GEq) por mezcla de reacción (CT & # x0003d & # x022123.3951 & # x000d7 registro10GEq & # x0002b 42,224 coeficiente de correlación [R 2], 0,9987). El límite de detección fue de 4 GEq por mezcla de reacción (CT, 33,5 & # x000b1 1,2, media & # x000b1 desviación estándar [SD] norte & # x0003d 20).

Investigar si el volumen de suero utilizado para el aislamiento del ADN influye en la probabilidad de C. burnetii Detección de ADN, comparamos volúmenes de entrada de 200 & # x003bcl y 500 & # x003bcl de sueros de fase aguda de 10 pacientes con infección por fiebre Q comprobada serológicamente. Con 200 & # x003bcl de suero, 8 de cada 10 muestras fueron positivas por duplicado y 2 de cada 10 muestras arrojaron un resultado positivo y otro negativo. Usando 500 & # x003bcl de suero, las 10 muestras fueron positivas por duplicado. El significado CT de las ocho muestras que dieron doble positivo con ambos volúmenes fue 33,4 & # x000b1 3,7 (200 & # x003bcl [media & # x000b1 SD]) y 31,7 & # x000b1 2,1 (500 & # x003bcl). Aunque el tamaño de la muestra fue pequeño, el aumento del volumen de entrada de 200 & # x003bcl a 500 & # x003bcl arrojó resultados más bajos CT valores y, por lo tanto, aumentó la posibilidad de C. burnetii Detección de ADN. Por lo tanto, para un análisis adicional, se aisló el ADN de 500 & # x003bcl de suero y se realizó la PCR por duplicado. A CT valor de & # x0003c45.0 se consideró positivo. Cuando la prueba arrojó un resultado positivo y negativo en la serie por duplicado, la PCR se consideró positiva.

Basado en resultados en silico, la secuencia del amplicón no mostró homología con secuencias de GenBank, EMBL, DDBJ o PDB distintas de las de C. burnetii (Búsqueda BLAST en http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). Para investigar más a fondo la especificidad de la prueba, 25 muestras de suero de pacientes que padecen infecciones del tracto respiratorio causadas por patógenos distintos de C. burnetii fueron probados en el IS1111 PCR. Ninguna de estas muestras de suero (0/25) dio positivo en el C. burnetii PCR en tiempo real.

Pacientes.

C. burnetii La PCR en tiempo real se realizó de forma retrospectiva en 65 muestras de suero de fase aguda y 65 de seguimiento en fase de convalecencia de 65 pacientes con fiebre Q aguda diagnosticada por IFA. La PCR fue positiva en 49/50 (98 & ​​# x00025) sueros seronegativos, 9/10 (90 & # x00025) sueros con anticuerpos IgM-II aislados, 3/13 (23 & # x00025) sueros con anticuerpos IgM-II / IgG-II, 2/41 (5 & # x00025) sueros con anticuerpos IgM-II / IgG-II / IgM-I, 0/15 (0 & # x00025) sueros con anticuerpos IgM-II / IgG-II / IgM-I / IgG-I, y 0/1 (0 & # x00025) muestra de suero con anticuerpos IgM-II / IgG-II / IgG-I (Fig. & # x200B (Fig.1). 1). CT los valores en sueros positivos para PCR variaron de 27,5 a 43,5. De las 63 muestras de suero con una PCR positiva, 6 muestras de suero de fase aguda y 3 de fase de convalecencia arrojaron solo un resultado positivo en la serie por duplicado.

Coxiella burnetii Porcentajes de positividad de PCR en tiempo real en muestras de suero de fase aguda y de seguimiento en fase de convalecencia de 65 pacientes con fiebre Q aguda. Los sueros se agruparon de acuerdo con los perfiles de anticuerpos determinados por el ensayo de inmunofluorescencia. La PCR fue positiva en 49/50 (98 & ​​# x00025) sueros seronegativos, 9/10 (90 & # x00025) sueros con anticuerpos IgM-II aislados, 3/13 (23 & # x00025) sueros con anticuerpos IgM-II / IgG-II, 2/41 (5 & # x00025) sueros con anticuerpos IgM-II / IgG-II / IgM-I, 0/15 (0 & # x00025) sueros con anticuerpos IgM-II / IgG-II / IgM-I / IgG-I, y suero 0/1 (0 & # x00025) con anticuerpos IgM-II / IgG-II / IgG-I.

La fecha de inicio de la enfermedad se pudo recuperar del sistema de información del hospital para 40/65 (62 & # x00025) pacientes. El último momento en el que C. burnetii Aún se pudo detectar ADN en el día 17 después del inicio de la enfermedad. Este suero en particular produjo solo un resultado positivo en la serie por duplicado, mientras que IFA reveló la presencia de anticuerpos IgM-II / IgG-II / IgM-I (Fig. & # X200B (Fig. 22).

Relación de CT valor, número de días después del inicio de la enfermedad y perfil de anticuerpos en 40 muestras de suero de fase aguda y 40 de seguimiento en fase de convalecencia de 40 pacientes con fiebre Q aguda para cuya fecha de inicio de la enfermedad se pudo recuperar del sistema de información del hospital . Los símbolos reflejan diferentes perfiles de anticuerpos: & # x02022, sueros seronegativos (norte & # x0003d 31) & # x025cb, sueros con anticuerpos IgM-II aislados (norte & # x0003d 6) & # x025aa, sueros con anticuerpos IgM-II / IgG-II (norte & # x0003d 9) & # x025a1, sueros con anticuerpos IgM-II / IgG-II / IgM-I (norte & # x0003d 24) & # x025b4, sueros con anticuerpos IgM-II / IgG-II / IgM-I / IgG-I (norte & # x0003d 9) & # x025b5, suero con anticuerpos IgM-II / IgG-II / IgG-I (norte & # x0003d 1). Undet., C. burnetii El ADN era indetectable.

En los 50 sueros de fase aguda de pacientes con una infección del tracto respiratorio de etiología desconocida y serología de fiebre Q no concluyente, la PCR fue positiva en 5/50 (10 & # x00025) casos. De estos cinco sueros PCR-positivos, un suero mostró un título de anticuerpos positivo contra Mycoplasma pneumoniae. Los 10 sueros de fase aguda de pacientes con un título de anticuerpos IgM-II inespecífico contra C. burnetii dio negativo en la PCR.


Conclusiones

El presente estudio reveló que el gen de madurez de la soja E9 es FT2a, un ortólogo de Arabidopsis FTy que su alelo recesivo retrasa la floración debido a una menor abundancia de transcripciones. FT2a por lo tanto, está directamente involucrado en la variación natural del tiempo de floración en la soja. La atenuación de FT2a La expresión es causada por la represión transcripcional específica del alelo causada por la inserción de DOLOR-1 en el primer intrón. El recesivo e9 El alelo es un alelo con fugas, su regulación por otros genes involucrados en la respuesta del fotoperíodo se retiene. Por lo tanto, puede mantener el crecimiento vegetativo en antecedentes genéticos de floración temprana y también ser útil como alelo juvenil largo en el desarrollo de cultivares en regiones de latitudes bajas, donde la floración se promueve fuertemente.


AA diseñó y realizó los experimentos, analizó los datos, escribió el manuscrito CD diseñó los experimentos, analizó los datos, revisó el manuscrito KK concibió el estudio, diseñó los experimentos, analizó los datos y revisó el manuscrito.

Nombre del archivo Descripción
feb212719-sup-0001-FigS1.pdfDocumento PDF, 187,4 KB Figura S1. (A) Representación esquemática de Snp organización genética adoptada de los datos de Flybase.org. Los recuadros grises corresponden a las UTR, los recuadros naranjas a la secuencia de codificación y las líneas a los intrones. Los sitios de inserción de elementos transponibles que provocan, Snp SH1834 y Snp c00465 También se representan mutaciones. (B) Análisis cuantitativo de PCR de Snp expresión de la transcripción en Snp SH1834 y Snp c00465 animales 46–48 h AEL. Desemparejado t-prueba con dos colas PAG-valor e intervalos de confianza del 95% se utilizaron para comparar la media de cada grupo con el tipo salvaje. El análisis se realizó mediante el software prism 7.
feb212719-sup-0002-FigS2.pdfDocumento PDF, 560,2 KB Figura S2. Secuencias adicionales de los extremos 3 'del ARNm de la histona 3.
feb212719-sup-0003-FigS3.pdfDocumento PDF, 132,6 KB Figura S3. Análisis de transferencia Northern de ARNr 5.8S en tipo salvaje, Snp SH1834 y Snp ARNi animales 46-48 h AEL (gel desnaturalizante de poliacrilamida-urea al 15%).

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Información de soporte

S1 Fig. Estados de cromatina específicos de alelo en el impreso KvDMR lugar.

(A) Pantalla de UCSC que muestra el KvDMR locus, incluido el sitio de inicio de la transcripción para el Kcnq1ot1 ARN no codificante, que es activo a partir del alelo paterno. Los datos de H3K9me3 ChIP y DNase-I – seq de mESC están disponibles a través de EncODE (ENCSR000CFZ, GSM1014187). Se indican las posiciones de los sitios diana de sgRNA y los amplicones de PCR utilizados durante el análisis. B. Sensibilidad a la ADNasa-I específica de alelo de las regiones indicadas en el panel A. Tenga en cuenta que la diana 2 está dentro de un sitio hipersensible a la ADNasa-I anotado, mientras que la diana 1 no lo está. Los núcleos de mESC se sometieron a digestión con concentraciones crecientes de DNasa-I durante 5 minutos a 37 ° C, antes de la extracción de ADN y la secuenciación de Sanger a través de SNP para revelar diferencias específicas de alelo en la digestión en las regiones indicadas en el panel A. (C) ChIP nativo enriquecimiento para las marcas H3K9me3 y H4K20me3 en las regiones correspondientes al sitio 1 y 2 & amp3 de sgRNA diana (amplicones indicados en el panel A). Los enriquecimientos se expresan en relación con la entrada y las barras de error representan la DE de tres réplicas técnicas. Los cebadores qPCR que abarcan retrotransposones de partículas intraesternales A (IAP) y el promotor actb sirven como controles positivos y negativos, respectivamente. D. Enriquecimiento específico de alelo en el ADN de ChIP para la región de la diana 1 que se muestra en el panel A determinado por análisis RFLP. Los datos son representativos de dos réplicas biológicas para cada línea mESC. Los datos cuantitativos subyacentes al panel C se proporcionan en S1 Data, y los detalles de las bibliotecas MiSeq, incluidas las accesiones SRA, se proporcionan en S2 Data. SRA, archivo de lectura de secuencia.

S2 Fig. Estados de cromatina específicos de alelo en el impreso Impacto lugar.

(A) Pantalla de UCSC que muestra el sitio de inicio de la transcripción para el Impacto gen, que está activo a partir del alelo paterno. Los datos de H3K9me3 ChIP y DNase-I – seq de mESC están disponibles a través de EncODE (ENCSR000CFZ, GSM1014187). Se indican las posiciones del sitio diana de ARNsg y los amplicones de PCR utilizados durante el análisis. (B) Sensibilidad de DNasa-I específica de alelo para una región que abarca el sitio de destino, como se indica en el panel A. (C) Enriquecimiento de ChIP para las marcas H3K9me3 y H4K20me3 en el Impacto sitio de destino de ARNsg. Los enriquecimientos se presentan de la misma manera que S1C Fig. (D) Enriquecimiento específico de alelo de ADN de ChIP en el Impacto Sitio diana de ARNsg determinado por secuenciación de Sanger a partir de ADN de ChIP a través de un SNP alélico. Los experimentos de ChIP son representativos de dos réplicas biológicas para cada línea mESC. (E) Metilación de CpG en el Impacto promotor presentado como se describe para la Fig. 1D. La línea punteada negra indica el nivel esperado de metilación en todos los alelos cuando la impronta se mantiene por completo. (F) Análisis de mutaciones específicas de alelos de experimentos usando sgImpact en células recolectadas 96 horas después de la transfección. Los datos se presentan como se describe en la Fig 2. Las barras de error representan SD, norte = 3 réplicas biológicas. Los datos cuantitativos subyacentes a los paneles C, E y F se proporcionan en S1 Data, y los detalles de las bibliotecas MiSeq, incluidas las accesiones SRA, se proporcionan en S2 Data. SRA, archivo de lectura de secuencia.

S3 Fig. Estados de cromatina específicos de alelo en el impreso Inpp5f_v2 lugar.

(A) Pantalla de UCSC que muestra el sitio de inicio de la transcripción para el Inpp5f_v2 transcripción, que se inicia a partir del alelo paterno. Datos de H3K9me3 ChIP y DNase-I – seq de los ESC de ratón disponibles a través de EncODE (ENCSR000CFZ, GSM1014187). Se indican las posiciones del sitio diana de ARNsg y los amplicones de PCR utilizados durante el análisis. (B) Sensibilidad de ADNasa-I específica de alelos para un amplicón de PCR que abarca el Inpp5f_v2 Sitio diana de ARNsg, como se describe en la Fig. S1B. ND = no realizado debido a una mala amplificación por PCR en estas muestras. (C) Enriquecimiento de chips para las marcas H3K9me3 y H4K20me3 en el Inpp5f_v2 sitio de destino de ARNsg. Los enriquecimientos se presentan de la misma manera que S1C Fig. (D) Enriquecimiento específico de alelo en experimentos de ChIP en el Inpp5f_v2 Sitio objetivo de sgRNA determinado por análisis RFLP de productos de PCR amplificados a partir de ADN de ChIP. Los experimentos de ChIP son representativos de dos réplicas biológicas para cada línea mESC. (E) Metilación de CpG en el Inpp5f_v2 promotor presentado como se describe para la Fig. 1D. Los niveles de metilación se midieron por separado después de cada transfección, los datos que se muestran aquí son representativos. La línea punteada negra indica el nivel esperado de metilación en todos los alelos cuando la impronta se mantiene por completo. Tenga en cuenta la LOI parcial que es evidente en los paneles B, D y E, particularmente en la línea B × J mESC. Los datos cuantitativos subyacentes a los paneles C y E se proporcionan en S1 Data, y los detalles de las bibliotecas MiSeq, incluidas las accesiones SRA, se proporcionan en S2 Data. SRA, archivo de lectura de secuencia.

S4 Fig. La heterocromatina impide la mutagénesis de una manera dependiente de la concentración de Cas9.

(A) Las células B × J de la transfección mostrada en la Fig. 2A se purificaron con FACS de acuerdo con el esquema de activación mostrado. Tenga en cuenta que este panel muestra los mismos datos que se muestran en el panel 2A. (B) Análisis de mutación específica de alelo dentro de poblaciones de células que expresan diferentes niveles de Cas9, como se muestra en el panel A, FACS purificado 24 horas después de la transfección y luego sometido a análisis de mutación específica de alelo inmediatamente, sin más tiempo en cultivo. Se obtuvieron insuficientes células J × B después de FACS para evaluar la mutagénesis después de 24 horas. (C) Los histogramas apilados muestran el sesgo de mutación alélica en cada réplica experimental. Las barras de error representan la DE de tres réplicas biológicas. Se realizó un ANOVA unidireccional utilizando la diferencia de veces entre las frecuencias de mutación en los alelos maternos frente a los paternos para determinar si esto se veía afectado por el nivel de expresión de Cas9. Se encontraron efectos significativos (pag & lt 0,05). Los asteriscos denotan pag-valores para la prueba HSD de Tukey en las comparaciones por pares especificadas. *pag & lt 0,05. Los datos cuantitativos subyacentes a los paneles B y C se proporcionan en S1 Data, y los detalles de las bibliotecas MiSeq, incluidas las accesiones SRA, se proporcionan en S2 Data. SRA, archivo de lectura de secuencia.

S5 Fig. Mayor ocupación de Cas9 en eucromatina en comparación con heterocromatina.

(A) Esquema que representa el flujo de trabajo experimental para los experimentos de Cas9 ChIP. (B, C) Los histogramas apilados muestran el enriquecimiento de ChIP para dCas9-3xFLAG en regiones que abarcan sgKvDMR # 1 (panel B) y sgImpact (panel C), expresado en relación con el ADN de entrada. Los enriquecimientos generales se determinaron mediante qPCR, y luego los amplicones de PCR separados se sometieron a secuenciación profunda de amplicones para determinar la proporción de productos de alelos maternos (rojo) a paternos (azul). Cada serie de tiempo se realizó una vez en células B × J únicamente. Las barras de error representan la DE de la recuperación total de reacciones técnicas de qPCR por triplicado. Los datos cuantitativos subyacentes al panel B se proporcionan en S1 Data, y los detalles de las bibliotecas MiSeq, incluidas las accesiones SRA, se proporcionan en S2 Data. SRA, archivo de lectura de secuencia.

S6 Fig. Las mismas clases de InDel se repiten en heterocromatina y eucromatina 96 horas después de la transfección.

El tamaño y la frecuencia de los cinco InDels más comunes (desglosados ​​por alelo parental) producidos por cuatro sgRNA diferentes que se dirigen a la heterocromatina impresa. El ADN genómico editado se extrajo 4 días después de la transfección con sgRNA dirigidos al KvDMR (paneles A y B), Impacto (panel C) e Inpp5f_v2 (panel D) imprimieron loci en las celdas B × J (izquierda) y J × B (derecha). Los tamaños de eliminación se representan contra la barra de escala en la parte superior de cada panel, y el número de bases insertadas se indica junto al rectángulo azul. Tenga en cuenta que teóricamente se puede insertar cualquiera de los cuatro nucleótidos posibles, por lo que en algunos casos se observó más de una inserción +1. La línea roja horizontal indica el sitio de división previsto y la clave de color para todos los paneles se encuentra en la parte inferior izquierda de la figura. La fracción de Indels se calculó como el número de lecturas correspondientes a cada clase de mutación específica, expresada como una proporción de todas las lecturas que contienen InDel. La fracción de hebras hipermetiladas en células transfectadas de forma simulada se indica debajo de cada gráfico. Los detalles de las bibliotecas MiSeq, incluidas las accesiones SRA, se proporcionan en S2 Data. SRA, archivo de lectura de secuencia.


Materiales y métodos

Plant materials and growth conditions

Yuanjiang common wild rice (YJCWR, Oryza rufipogon Griff.), a common wild rice accession collected as rhizomes from Yunnan Province, China, and Teqing, an elite indica cultivar (O. sativa L.), were used as donor and recurrrent parents in the process of construction of a set of introgression lines, respectively. YIL79 is one introgression line displaying a late heading date. F1 plants were derived from a cross between YIL79 and Teqing. The population (F2) used for high-resolution mapping was self-pollinated progenies of F1.

YIL79, Teqing, and the map population were grown in Beijing (day length > 14 h). Transgenic plants and the material used for analyzing the expression of LHD1 and other heading date genes were grown under long-day conditions (14 h light/10 h dark) and short-day conditions (10 h light/14 h dark), respectively.

DNA extraction and genotype analysis

Fresh leaves were collected at the seedling stage and then ground in liquid nitrogen. DNA was then extracted by the standard cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) method ( Rogers and Bendich 1988 ). A total volume of 20 μL reaction mixture was composed of 1 ng/μL template DNA, 2μL of 10× buffer (0.1 mol/L Tris-HCl (pH 9.0), 0.5 mol/L KCl, 7.5 mmol/L MgCl2, 0.1% Triton X-100), 2 μmol of each primer, 2.5 mmol/L each of deoxynucleotide triphosphates (dNTP) and 1 unit of Taq DNA polymerase (Promega). Amplification was carried out on the program for the initial denaturing step with 94 °C for 5 min, followed by 35 cycles for 1 min at 94 °C, 1 min at 55 °C, 2 min at 72 °C, with a final extension at 72 °C for 10 min.

Fine-mapping of LHD1

We used the F2 population, derived from the backcross between Teqing and YIL79, to map the LHD1 gene. Firstly, we select 200 F2 individuals to do preliminary genetic mapping of the LHD1 locus, and LHD1 was then mapped between SSR markers RM38 and RM126. An additional 1 900 F2 plants were used to fine-map the LHD1 gene. Two insertion-deletion (InDel) markers M4560 and M5164136 flanking LHD1 identified nine and two recombinant plants, respectively. Finally, six new polymorphic markers in this region were developed, and LHD1 was subsequently narrowed down to within a 25-kb genomic region between the M516470 and M516495 markers. The molecular markers used for fine-mapping LHD1 are shown in Table S3.

Vector construction and transformation

For complementation tests, a positive bacterial artificial chromosome (BAC) clone including LHD1 was isolated from the genomic BAC library of YJCWR. A 3688-bp fragment including a 1461-bp upstream sequence, the putative coding region, and a 1324-bp downstream sequence digested by HindIII was inserted into the binary vector pCAMBIA1300. The construct p35S::LHD1-GFP containing LHD1 fused with GFP was driven by an CaMV 35S promoter. The construct p35S::LHD1-GFP was transformed into onion epidermal cells by particle bombardment, and other plasmid constructs were transferred into rosal japonés cultivar Zhonghua 17 via particle bombardment transformation.

Semi-quantitative RT-PCR and quantitative RT-PCR analysis of gene expression

We extracted the total RNA from leaves using an RNeasy Plant Mini Kit (Qiagene). First-stand cDNA synthesis was done from 2 μg of total RNA, using the BcaBEST RNA PCR Kit (TaKaRa). We carried out Semi-quantitative RT-PCR to amplify the LHD1 transcripts with the primers sqLhd1F and sqLhd1R. Quantitative RT-PCR was done using the ABI Prism 7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems). cDNA corresponding to 5 ng of total RNA was used as the template and was amplified with primers qLhd1F and qLhd1R using the SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems Incorporation). We normalized the levels of LHD1 transcripts by endogenous 18S rRNA transcripts amplified with primers 18SF and 18SR. Each set of experiments was repeated three times, and the relative quantification method (ddCt) was used to evaluate quantitative variation. The quantitative real-time PCR procedure was conducted at 94 °C for 3 min, followed by 40 cycles at 94 °C for 30 s, 58 °C for 30 s, and 72 °C for 30 s.


MATERIALES Y MÉTODOS

Subjects and Samples

The case-control study consisted of 320 patients with lung cancer and 362 healthy controls. All subjects were unrelated ethnic Han Chinese and participants in our previous epidemiological study of lung cancer. 19 The cases with primary lung carcinoma were recruited from January 1997 to November 2001 at the Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences (Beijing). The exclusive criteria included previous cancer and previous radiotherapy or chemotherapy. All patients, without age, sex, and histology restrictions, were from Beijing City and its surrounding regions. Surgically resectable patients were mostly recruited. Population controls were accrued from a nutritional survey conducted in the same region during the period of case collection. They had no history of cancer and were frequency matched to case on age and sex. Informed consent was obtained from each subject at recruitment, and this study was approved by the institutional review board of the Chinese Academy of Medical Sciences Cancer Institute.

Genotype Analyses

Genomic DNA of controls and cases were extracted from peripheral blood leukocytes. Polymorphisms in the MCL1 promoter were genotyped with polymerase chain reaction (PCR)-resequencing method using forward primer 5′-AGATGGGAGAAGCAAGCAGG-3′ and reverse primer 5′-AAGCGGAAGTGAGAAGTGGC-3′. The PCR products were subject to direct sequencing on an ABI Prism 377 DNA Sequencer.

Statistical Analyses

We used chi-square tests to examine differences in demographic variables, smoking status, genotypes between cases and controls, and deviations of genotype frequencies in controls and in cases from those expected under Hardy-Weinberg equilibrium (HWE). We calculated linkage disequilibrium (LD) index (r 2 ) with LDA software 20 and predicted haplotype with PHASE. 21 We estimated cancer risk associated with genotypes or diplotypes by calculating crude and adjusted odds ratio (OR) and their 95% confidence interval (95% CI) with unconditional logistic regression models. Age, sex, and pack-years smoked were included for multivariate adjustment. Information was collected on the number of cigarettes smoked per day, and the age at which the subjects started smoking and stopped smoking. Subjects who never smoked or smoked <100 cigarettes before the date of diagnosis for patients or the date of interview for controls were defined as nonsmokers. Light and heavy smokers were categorized using 50 percentile pack-year ([cigarettes per day/20] × ([years smoked]) values of controls as cutoff points (ie, ≤26 and >26 pack-years). The probability level of <.05 was used as criterion of statistical significance, and all statistical tests were 2 sided. These statistical analyses were performed by using Stata software (version 8.0).

Electrophoretic Mobility Shift Assay (EMSA)

We used the EMSA assay to analyze allele-specific binding of nuclear protein to the MCL1 promoter. Synthetic double-stranded oligonucleotides 5′-CTCAGGCCCCGGC CCCGGCC-3′ (0 nt), 5-′CTCAGGCCCCGGCCCCG GCCCCGGCC-3′ (6 nt), and 5′-CTCAGGCCCCGGC TCAGGCCCCGGCCCCGGCCCCGGCC-3′ (18 nt) corresponding to the MCL1-190 insertion polymorphisms sequence (inserted nucleotides shown in bold) were labeled with biotin. EMSA was performed by using the LightShift Chemiluminescent EMSA Kit (Pierce Rockford, Ill). Briefly, a biotin-labeled probe was combined with nuclear protein extract from an A549 cell. The unlabeled probe and an Sp1 consensus-binding site probe (5′-GCTCGCCCCGCCCCGATCGAAT-3′) were used for competition assays. After electrophoresis of reaction mixture, gel was transferred to nylon membrane and crosslink was performed with a UV crosslinker (HL-2000 Hybrolinker, UVP). Biotin-labeled DNA on the membrane was detected with stabilized Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate.

Reporter Gene Assay

We conducted transient transfection and luciferase assays to address differential promoter activity of MCL1 regulatory variants. Four allelic reporter constructs were prepared by amplifying the MCL1 promoter region of the 907-bp length (from −944 to −37 relative to translation start site) with primers: 5′-GGTACCGAATCGTCTGA ACG-3′ (forward) and 5′-GGAAGACCCCGACTCC TTA-3′ (reserve), followed by cloning into a pGL2 basic vector. Human lung cancer cell line A549 and esophageal cancer cell line Eca109 were cotransfected with these constructs and pRL-CMV vector, as internal control, using Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, Calif). The pGL2 basic vector without any insertion was used as the negative control. For each plasmid construct, 3 independent transfection experiments were performed and each were done in triplicate. Luciferase activity was measured using Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI) on a Veritas microplate luminometer (Turner Biosystems, Madison, Wisc). Transcriptional activity for each construct was calculated as fold change of luciferase activity of each construct to that of the pGL2 basic vector.

Real-time quantitative RT-PCR

To analyze the correlation between genotype and transcript expression, we measured MCL1 mRNA in lung cancer tissues. Total RNA was isolated from lung tumor tissues with Trizol. After first-strand cDNA was synthesized, real-time quantitative RT-PCR was performed with SYBR Premix Ex Taq Kit (Takara, Japan) on Applied Biosystems 7500. cDNA was amplified with primers 5′-GAGGCTG CTTTTCTTCGC-3′ (forward) and 5′-CCGTCCGTAC TGGGTTATT-3′ (reverse). Expression of beta-actin was measured as internal control with primers 5′-CAGAG CCTCGCCTTTGCC-3′ (forward) and 5′-ATGCCGGA GCCGTTGTCG-3′ (reserve). Expression levels were normalized to the referent by relative quantification using ΔΔCT método. Expression analysis was performed in triplicate for each sample.

Immunohistochemistry

We measured MCL1 protein in lung cancer tissues to analyze correlation between genotype and protein expression. Formalin-fixed, paraffin-embedded lung cancer tissues sectioned at 4 μm were prepared for immunohistochemical analysis of MCL1. The endogenous peroxidase activity was blocked with 3% H2O2. The slides were incubated over night at 4°C with antibody for MCL1 (rabbit polyclonal antibody, ProteinTech Group, Chicago, Ill). Adding biotin-labeled goat antirabbit IgG for 30 minutes, peroxidase-labeled avidin-biotin for 1 hour, then DAB for enzymatic development of peroxidase. Sections were then counterstained with hematoxylin, dehydrated, mounted, and coverslipped. For each slide, mean density for images from light microscopy random fields (×200) representing the expression level of MCL1 was calculated using Image-pro plus software (Bethesda, Md).

Cell Proliferation Assay

We further analyzed the effect of MCL1 expression on proliferation of lung cancer cell line A549. Full coding sequence of MCL1 cDNA was amplified and cloned into pcDNA3.1 (called pcDNA3.1-MCL1), using forward primer: 5′-ACC CTCGAG (Xhol) TCGGGGTCTTCCC CAGTTTT-3′ and reverse primer: 5′-ACC GGATCC (BamHl) ATCTTATTAGATATGCCA AACCAGCT-3′. MCL1 siRNA and nontargeting negative control (NC) siRNA were commercially synthesized (RiboBio Co, Ltd, China). The targeting sense sequence is 5′-GGACTT TTATACCTGTTAT-3′. The NC siRNA sequence is 5′-TTCTCCGAACGTGTCACGTdTdT-3′. MCL1 and siRNA expression vectors were transiently transfected into A549 cells with Lipofectamine 2000 (Invitrogen). After 72 hours, lysates were prepared for Western blot with MCL1 antibody (Protein Tech Group, Inc, China) and β-Actin antibody (Abmart, China) as inner control. The A549 cells were counted and plated at 4 × 10 3 cells/well in 96-well plate. After 24 hours culture, MCL1-siRNA and NC-siRNA at 50 nM/well, pcDNA3.1-MCL1 and pcDNA3.1 at 0.2 μg/well were transfected, respectively, in 6 wells. Cell viability was detected using Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories, Japan) 1, 3, and 5 days after transfection.


Métodos

Study site

Lake Zürich in Switzerland (47°15'N, 8°38'E, 406 m above sea level) is a deep (mean depth 51 m, maximum depth 136 m), monomictic lake with a surface area of 68 km 2 . The first signs of Lake Zürich eutrophication were observed before 1890 (problems with the clogging of drinking water filters due to high zooplankton biovolumes). At the peak of eutrophication in 1965, the total phosphorus concentration reached a maximum of 100 μg L -1 at spring overturn [50] and the Planktothrix abundance was close to zero from 1965 to 1975. Since 1975, the Planktothrix population has recovered and has an average share of 33% per year (minimum 0.1%, maximum 68%) of the total phytoplankton biovolume between 1980 and 2008. Today, Lake Zürich is classified as mesotrophic with average total phosphorus concentrations of 23 μg L -1 (minimum 3.9 μg L -1 , maximum 78.1 μg L -1 ) between 1980 and 2008. For the analysis of both phytoplankton and total phosphorus concentrations (Figures 1 and 2 and Figure S1A in Additional file 1), the average of the countings between the surface and 20 m in depth (0, 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 12.5, 15 and 20 m) of the monthly sampling data was used.

Extraction of DNA from archived phytoplankton samples

A total of 111 samples from 1977 to 2008 were analyzed (in 1981 and 1998, no sampling was performed). The samples originated from a biweekly monitoring program targeting the euphotic zone by separate filtration of two liters from depths of 0, 5, 10 and 20 m through glass fiber filters, which were subsequently dried at 110°C for 2 h and stored in a desiccator until the next day. The filters were glued on paper and stored at room temperature (Figure S3 in Additional file 1). Filters were inspected and four filters from each year that showed maximum biomass were used for DNA extraction. Thus, the sampling depth varied according to the occurrence of the maximum population density. From the majority of the samples, one half of the filter with the preserved phytoplankton was used for DNA extraction, from ten samples only one quarter of the filter was used, and from three samples (600 mL from different depths, 7 December 1977) the phytoplankton of the complete filter was used for DNA extraction.

DNA was extracted from filters using the chloroform-phenol method as previously described [51]. The extracted DNA was precipitated from the aqueous phase by adding half the sample volume of ammonium acetate (7.5 M), one tenth of the sample volume of magnesium chloride (0.1 M), 1 μL of glycogen (Fermentas, St. Leon-Rot, Germany) and one sample volume of isopropanol before overnight incubation (-20°C). After centrifugation (16,000 g, 4°C, 1 h) the supernatant was discarded and samples were washed twice with 70% ethanol by centrifugation (20 min, 4°C). The DNA pellets were dried in a sterile hood and resuspended in 50 μL of sterile Millipore water.

Design of qPCR TaqMan assays (Taq nuclease assay)

Samples were analyzed by TNA for the total population of Planktothrix by the 16S rDNA locus [11] and the PC-IGS [46] for the abundance of the mcyB genotype encoding MC synthesis [12] for the abundance of various mutant mcy genotypes carrying either a deletion or insertion inactivating MC biosynthesis [22], such as mcyDIS1, mcyDIS2, mcyAIS (insertion of a transposable element into the mcy gene cluster) and mcyHA (deletion of 1.8 kbp between mcyH and mcyA) for the abundance of the nontoxic genotype that lost the mcy gene cluster [4] and for the abundance of red-pigmented versus green-pigmented ecotypes via the IGS between psaA and psaB (PSA-IGS see below). The nontoxic genotype that lost the mcy gene cluster, except for mcyT, was differentiated from the genotype still containing the mcy gene cluster using a SNP. The primers and TaqMan probes for the 16S, PC-IGS, the mcyB gene and the four inactive mcy genotypes have been published previously (Table 2). For the design of TNAs targeting the PSA-IGS locus, sequences from 62 Planktothrix strains (GenBank:EU258202 to EU258263[4]) were aligned together with 78 sequences of Planktothrix strains isolated from Europe, North America and East Africa (R. Kurmayer, unpublished) by means of Clustal W 2.0. A target region was identified that discriminates all the strains of lineage 1 (norte = 56 containing strains that are green-pigmented and lost the mcy gene cluster) from strains of lineage 2 (norte = 84 containing both red-pigmented and green-pigmented strains that always retained the full mcy gene cluster). The following forward primers, TaqMan probes and reverse primers were designed: lineage 1 (167 bp): forward primer PSA I + (5'-CCAGCAATTCAACCTCGC-3'), TaqMan probe PSA I (5'-TGGTGTAGCTCACTACCTCTTAGGAGGCAT-3') and reverse primer PSA I- (5'-AAAGTAGATTAGATTTCCTCCCACCT-3') lineage 2 (158 bp): forward primer PSA II + (5'-CCAGCAATTCAACCTCGC-3'), TaqMan probe PSA II (5'-CGTGCGGTTGGTGTAGCTCACTACC-3') and reverse primer PSA II- (5'-ATTCAGCCTTTCCCAGTCCC-3'). Both probes were labeled with 6-carboxyfluorescein (FAM) at the 5'-end and BlackBerry Non-Fluorescent Quencher (NFQ) at the 3'-end.

Detection of the nontoxic genotype by single nucleotide polymorphism (custom TaqMan genotype assay)

In total, 113 mcyT sequences (GenBank: EU266304 to EU266364, and RK, unpublished Table S1 in Additional file 1) of both toxic and nontoxic strains were aligned. A SNP was found to discriminate all the strains that lost the mcy gene cluster from strains that still contain the full mcy gene cluster. A custom TaqMan SNP genotyping assay based on this SNP was created using the Custom TaqMan Assay Design Tool (Applied Biosystems, ABI, Vienna, Austria) to differentiate the two genotypes. The following forward and reverse primers and two TaqMan probes labeled with 4,7,2'-trichloro-7'-phenyl-6-carboxyfluorescein (VIC) or FAM at the 5'-end and a NFQ at the 3'-end were obtained: mcyT SNP + (5'-ACAGAGAAAGCCGAGTTGGTT-3'), mcyT SNP-(5'-AGATTTGAAACCTAACGCCTTGGA-3'), TaqMan Probe allele 1 (VIC 5'- TGTTCCCACCAAGCTT-3' NFQ) and TaqMan Probe allele 2 (FAM 5'- CCCGCCAAGCTT-3' NFQ) (66 bp). The specificity and sensitivity of the assay were tested by measuring the mixtures of DNA from axenic strains PCC7811 (loss of the mcy gene cluster except the mcyT gene) and PCC7821 (containing the mcy gene cluster).

Setup of qPCR TaqMan assays

All the samples were measured in triplicate in a total volume of 25 μL including 5 μL of template DNA. The initial denaturation of 10 min at 95°C was followed by 50 cycles of a two-step PCR with an annealing and elongation temperature of 60°C or 55°C on an Eppendorf Master Cycler Ep Realplex system (Eppendorf, Vienna, Austria), as described [11]. To increase the DNA concentration in the template as much as possible, the inactive mcy genotypes were measured in a total volume of 12.5 μL including 1 μL of the pure DNA extract and 1 μL (50 μg μL -1 ) of bovine serum albumin. Because these results were frequently below the limit of quantification, only a presence/absence analysis was performed.

TaqMan assays were tested for specificity and sensitivity using dilution series of DNA isolated from Planktothrix strains 110, 139, 40 and 62, as described (Table 2) [22]. Calibration curves were also prepared from a dilution series of DNA from strains PCC7811 and PCC7821 for the TNA PSA I and PSA II, representing lineage 1 or lineage 2 [4]. Strains PCC7811 and PCC7821 were grown at 20°C in a BG11 medium under continuous light (5 to 15 μmol photons m -2 s -1 ) and the cells were harvested during logarithmic growth. For each TNA calibration curve, the predetermined DNA concentrations in the template (expressed as biovolume per template) were diluted and related to the measured Ct values [22]. The limit of quantification was defined as the lowest concentration of the calibration curve, which corresponded to 3 to 18 cells per template for the individual assays (Table 2). In the case that the Ct values of a particular gene locus were below the limit of quantification, only the results from the 16S rDNA locus were included in the analysis (norte = 8).

TaqMan Genotype Assay (single nucleotide polymorphism)

All the samples were measured in triplicate on a ViiA7 Real-Time PCR System (ABI, Vienna, Austria), using the ViiA7 software (version 1.2.1) in a total volume of 12.5 μL including 2.5 μL of template DNA, ABI TaqMan Universal PCR Master Mix, the SNP Genotyping Assay Mix and sterile water according to the manufacturer's recommendations. A two-step PCR of 55 cycles was run with denaturation (92°C, 15 s) and annealing and extension (60°C, 1 min). The protocol included an initial denaturation step at 92°C for 10 min and a pre-read and post-read step at 60°C for 30 s, each. The relative threshold cycle was automatically set to 0.04 for all reads. The results were analyzed based on the delta Rn values (with Rn = fluorescence signal of reporter dye normalized to the fluorescence signal of the passive reference ROX) for allele 1 and allele 2, which represent the difference of the normalized fluorescence signal (VIC, FAM) between the pre-PCR and the post-PCR read.

To test the sensitivity and the specificity of the SNP assay, DNA of the axenic nontoxic strain PCC7811 was mixed down to 0.2, 0.5, 1, 2, 10, 20 and 50% of DNA from the toxic strain PCC7821 per template (calculated as cell equivalents). Dilution series from DNA of axenic strains PCC7811 and PCC7821 reaching from 2 to 180,000 and 2 to 230,000 cells per template, respectively, were established. At least one sample per year (1977 to 2008, norte = 35), as well as depth integrated and net samples (0 to 20 m) of Lake Zürich from the years 2005, 2006 and 2007 (norte = 16 [11]) were analyzed. In addition, samples of various European lakes composed of either green- or mixed-pigmented Planktothrix populations [12] were included (Table 1).

Statistical analyses

To calculate regression curves, the raw data were log10-transformed and tested for normal distribution (Shapiro-Wilks, PAG > 0.05) and for constant variance by computing Spearman's rank correlation between the absolute values of the residuals and the observed value of the dependent variable (PAG & gt 0,05). The residuals were tested for their independence from each other by the Durbin-Watson statistic.

The linear regressions between the total population density (as estimated from 16S rDNA) and the abundance of the mcyB gene and the two PSA-IGS genotypes (representing lineage 1 and lineage 2) were compared in terms of the slope and intercept using a general factorial model of ANOVA [52]. A SPSS statistical package (V 19.0 for Windows) was used. To compare the genotype proportions from samples between the three decades (1977 to 1989, 1990 to 1999, 2000 to 2008), the nonparametric Kruskal-Wallis one-way ANOVA on ranks was used.


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