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¿Por qué las mutaciones en Drosophila dsx (doble sexo) afectan tanto a hombres como a mujeres?

¿Por qué las mutaciones en Drosophila dsx (doble sexo) afectan tanto a hombres como a mujeres?


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Razón: La mutación con pérdida de función del gen dsx en el embrión femenino conduce a la producción de una proteína no funcional que no reprime la expresión del gen específico masculino. Así que los caracteres somáticos de ambos sexos persisten formando una intersexualidad ... Esto es todo lo que he descubierto.

Pero, ¿cuál es la razón de la aparición de personajes intersexuales en los machos de drosophila? ¿Se debe a una mutación de ganancia de función?


La expresión del gen del doble sexo es bastante inusual, por lo que no es sorprendente que tenga dificultades para comprender las mutaciones en él. El diagrama simplificado a continuación (adaptado de la Biología del desarrollo de Gilbert, disponible en línea) debería ayudar a aclarar el asunto.

El concepto clave es que aunque el gen del doble sexo (dsx) se expresa en moscas machos y hembras, los productos génicos (DsxF agregar DsxMETRO) son diferentes en los dos casos. Esto se logra mediante el empalme alternativo de la transcripción de ARN, controlado en última instancia por la dosis de cromosomas X e Y. (Si no está familiarizado con el empalme alternativo, ver p.ej. esta sección de [Biología molecular de la célula (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21558/).)

El segundo concepto importante (cuyos detalles, lo admito, conozco menos) es que el sexo está determinado tanto por la activación de genes específicos para el sexo particular como por la inactivación de genes del sexo opuesto. Por tanto, el diagrama muestra que DsxF ambos activa la expresión de genes para la diferenciación sexual femenina y reprime la expresión de genes para la diferenciación sexual masculina. Asimismo DsxMETRO activa la expresión de genes para la diferenciación sexual masculina y reprime la expresión de genes para la diferenciación sexual femenina.

Por tanto, de acuerdo con este esquema, si dsx está completamente inconsciente, habrá consecuencias tanto en hombres como en mujeres. En la hembra, en ausencia de DsxF, los genes para la diferenciación del sexo femenino no se activarán, pero los de la diferenciación del sexo masculino no serán reprimidos. Esto presumiblemente da como resultado el fenotipo intersexual. Asimismo, en el macho, la ausencia de DsxMETRO previene la expresión de los genes para la diferenciación sexual masculina, pero no reprime los de la diferenciación sexual femenina. Nuevamente, supongo que esto da como resultado el fenotipo intersexual.


Roles estratificados de infructuoso isoformas en la especificación y función de las neuronas promotoras de la agresión masculina en Drosophila

El comportamiento agresivo entre hombres es un comportamiento dimórfico sexual prominente. Por lo tanto, es probable que los circuitos neuronales que subyacen al comportamiento agresivo estén bajo el control de genes que determinan el sexo. Sin embargo, el mecanismo neurogenético que genera el comportamiento agresivo específico del sexo sigue siendo en gran parte desconocido. Aquí, encontramos que una clase neuronal especificada por uno de los Drosophila genes determinantes del sexo, infructuoso (fru), pertenece al circuito neuronal que genera conductas agresivas de tipo masculino. Esta clase neuronal puede promover un comportamiento agresivo independiente de otro gen determinante del sexo, doble sexo (dsx), a pesar de que dsx está involucrado en asegurar que el comportamiento agresivo se realice solo hacia los hombres. También encontramos que tres fru las isoformas con diferentes dominios de unión al ADN muestran una división del trabajo en los comportamientos agresivos masculinos. Un papel dominante de fru al especificar el comportamiento agresivo específico del sexo puede subrayar un mecanismo genético que permite que el comportamiento agresivo de tipo masculino evolucione al menos parcialmente de forma independiente del comportamiento de cortejo, que se encuentra bajo diferentes presiones selectivas.


Introducción

Los comportamientos sociales, como el cortejo y los comportamientos agresivos, son consecuencia de la aptitud de muchas especies animales. El comportamiento de cortejo masculino exitoso es vital para la propagación de la descendencia, mientras que el comportamiento agresivo intraespecífico suele ser la clave para garantizar el acceso a posibles parejas. Por tanto, estos dos comportamientos sirven para incrementar directa e indirectamente el éxito reproductivo de los machos. Probablemente debido a la contribución a un objetivo común, p. Ej. la reproducción, el cortejo y los comportamientos agresivos a menudo se regulan al alza o a la baja al mismo tiempo. En los vertebrados, las hormonas sexuales, como los estrógenos y las testosteronas, orquestan los comportamientos reproductivos sexualmente dimórficos organizando los circuitos neuronales subyacentes durante el desarrollo y activando estos comportamientos durante las etapas adultas (McCarthy, 2008 McEwen, 1981 Tinbergen, 1951). Sin embargo, la expresión de cortejo o agresión al sexo objetivo incorrecto puede ser costosa. Por lo tanto, un animal debe estar equipado con un mecanismo neuronal que co-regule estos dos comportamientos al mismo tiempo que ejecuta cada acción de manera selectiva hacia el objetivo correcto. La forma en que el sistema nervioso gestiona estas dos demandas aparentemente conflictivas sigue siendo una cuestión central en la neurobiología de los comportamientos sociales (Anderson, 2016 Chen y Hong, 2018 Li y Dulac, 2018).

Un posible mecanismo que puede explicar la ejecución selectiva del sexo objetivo de un comportamiento apropiado es que las señales sensoriales específicas del sexo se canalizan en un circuito dedicado, que a su vez desencadena un comportamiento específico hacia cada sexo (Kohatsu et al., 2011 Ruta et al. al., 2010 von Philipsborn et al., 2011). Esta cadena hipotética de neuronas a veces se denomina "línea etiquetada" (Ishii et al., 2017). En este circuito relativamente rígido, la información sensorial conductualmente relevante representada en el cerebro se transforma en la ejecución motora de la conducta sexualmente dimórfica de una manera estereotipada (Chen y Hong, 2018 Manoli et al., 2013). En pocas palabras, la hipótesis de la línea etiquetada predice que la activación de cualquier neurona que se encuentre aguas abajo de la percepción sensorial ('liberador' en un término clásico de Tinbergen, 1951) debería, en principio, desencadenar el comportamiento de interés, independientemente de la presencia de estímulos externos (von Philipsborn et al., 2011). Las señales sensoriales específicas del sexo están representadas de forma diferencial en el cerebro de hombres y mujeres (Bayless et al., 2019 Bergan et al., 2014 Datta et al., 2008 Haga et al., 2010 Kohatsu et al., 2011 Kohl et al. ., 2013 Li et al., 2017 Remedios et al., 2017), lo cual es consistente con un mecanismo simple de dos pasos que genera comportamientos sexualmente dimórficos: reconocimiento de sexo, seguido de ejecución de comportamientos específicos de sexo.

Curiosamente, se sabe que ciertas poblaciones de neuronas son capaces de promover conductas agresivas y de cortejo. En ratones, la estimulación de neuronas en el hipotálamo ventromedial (Lee et al., 2014) y la amígdala medial (Hong et al., 2014) induce ambos comportamientos. En las moscas de la fruta, las neuronas ubicadas en la parte medial posterior del cerebro masculino (comúnmente denominadas neuronas "P1" o "pC1") muestran una funcionalidad dual similar (Hoopfer et al., 2015 Koganezawa et al., 2016). Aunque se han propuesto varios mecanismos para explicar la generación de dos comportamientos por una población aparentemente única de neuronas (Anderson, 2016 Koganezawa et al., 2016), sigue existiendo una suposición implícita subyacente de que el patrón de activación de las neuronas dadas determina el resultado conductual . Sin embargo, para la amígdala medial de ratón y el hipotálamo ventromedial (Li et al., 2017 Remedios et al., 2017), los patrones de activación específicos del sexo objetivo no están programados, sino que surgen como resultado de interacciones entre especies. Además, ciertos aspectos del comportamiento agresivo inducido por la estimulación artificial del hipotálamo ventromedial del ratón pueden ser modulados por contextos sociales, incluido el sexo de los animales objetivo (Lin et al., 2011 Yang et al., 2017). Estas observaciones plantean la posibilidad de que la jerarquía entre el mecanismo de reconocimiento del sexo y el mecanismo de ejecución no sea tan unidireccional como sugiere un modelo de "línea etiquetada". El aumento de la precisión celular para la manipulación neuronal, especialmente junto con la precisión temporal de la optogenética, brinda una oportunidad única para abordar cómo el mecanismo de reconocimiento del sexo y el mecanismo de ejecución interactúan entre sí, y en qué parte del circuito neuronal se encuentra la especificidad del comportamiento hacia un sexo determinado. generado.

Aquí, abordamos los orígenes genéticos y neuronales de los dos mecanismos (reconocimiento sexual y ejecución de comportamientos) subyacentes a los comportamientos sociales sexualmente dimórficos de la mosca de la fruta. Drosophila melanogaster. En lugar de hormonas sexuales, Drosophila utiliza dos genes determinantes del sexo, doble sexo (dsx) y infructuoso (fru), para especificar dimorfismos sexuales a nivel celular. Encontramos que la estimulación optogenética de un subconjunto específico de neuronas P1 / pC1 induce más comportamiento de cortejo hacia las mujeres que hacia los hombres. El dimorfismo sexual neuroanatómico de este subconjunto P1 / pC1 se especifica predominantemente por dsx, y su capacidad para promover el noviazgo se mantiene independientemente de fru función. Sin embargo, fru Es necesario mejorar el comportamiento de cortejo específicamente hacia objetivos femeninos después de la estimulación optogenética. También encontramos evidencia de que las neuronas P1 / pC1 consisten en poblaciones genéticamente y funcionalmente heterogéneas, una de las cuales requiere la contribución de ambos dsx y fru para la especificación del dimorfismo sexual neuroanatómico. Por último, a diferencia del comportamiento de cortejo, el comportamiento agresivo requiere una fru-mecanismo de ejecución dependiente. Nuestros estudios iluminan la importancia previamente subestimada del sexo de un animal objetivo como una variable biológica relevante para el comportamiento, y sugieren que la relación entre el mecanismo de reconocimiento del sexo y el mecanismo de ejecución del comportamiento es más interactiva que jerárquica. Para el comportamiento de cortejo, la función de dsx se asemeja al papel organizativo de la hormona esteroide de vertebrados, mientras que la función de fru puede enmarcarse como el rol de activación. Esta separación de funciones no se extiende al comportamiento agresivo, lo que sugiere que los mecanismos de ejecución para diferentes tipos de comportamientos sociales sexualmente dimórficos pueden especificarse a través de mecanismos genéticos separables. El enfoque neurogenético que empleamos presenta un camino para diseccionar los orígenes genéticos y de circuitos de los comportamientos sociales sexualmente dimórficos.


Resultados

Se requieren altos niveles de proteína en la dieta para aumentar la plasticidad del tamaño corporal dependiente de los nutrientes en las hembras

Estudios anteriores identificaron una diferencia de sexo en la plasticidad dependiente de los nutrientes en varios rasgos morfológicos (Shingleton et al., 2017 Stillwell et al., 2010 Teder y Tammaru, 2005). Para determinar si existen diferencias sexuales en la plasticidad del tamaño corporal dependiente de los nutrientes en Drosophila, medimos el volumen de la pupa, una lectura establecida para Drosophila tamaño corporal (Delanoue et al., 2010), en blanco 1118 (w FBgn0003996) machos y hembras criados con dietas con cantidades variables de nutrientes. Encontramos que el volumen de pupa en w 1118 Las larvas de hembras criadas con la dieta de dos ácidos (1X) (Lewis, 1960) eran significativamente más grandes que las hembras del mismo genotipo criadas con una dieta con la mitad de la cantidad de nutrientes (0,5X) (Figura 1 - Figura suplemento 1A). En w 1118 En los machos, el volumen de pupa también fue significativamente mayor en las larvas criadas con la dieta 1X en comparación con la dieta 0.5X (Figura 1 — figura del suplemento 1A). No se detectó interacción significativa de sexo por dieta usando un análisis de varianza bidireccional (ANOVA) (interacción sexo: dieta p = 0,7048 Archivo complementario 1), lo que sugiere que la plasticidad del tamaño corporal dependiente de los nutrientes no fue diferente entre los sexos en este contexto. A continuación, comparamos el volumen de pupa en w 1118 machos y hembras criados con la dieta 1X con larvas cultivadas con una dieta con el doble del contenido de nutrientes (2X). Volumen de pupa en w 1118 las hembras fueron significativamente más grandes en las larvas criadas con la dieta 2X en comparación con las larvas cultivadas con la dieta 1X (Figura 1 — suplemento de figura 1A). En w 1118 En los machos, la magnitud del aumento dependiente de nutrientes en el volumen de pupa fue menor en comparación con las larvas femeninas (Figura 1 — figura del suplemento 1A interacción sexo: dieta p & lt0.0001 Archivo suplementario 1). Esto sugiere que en condiciones ricas en nutrientes, existe una diferencia de sexo en la plasticidad fenotípica, donde la plasticidad del tamaño corporal dependiente de los nutrientes es mayor en las hembras. Para representar las respuestas de tamaño corporal normal de cada sexo a la cantidad de nutrientes, graficamos las normas de reacción para el volumen de pupa en w 1118 machos y hembras criados con diferentes dietas (Figura 1 — Suplemento de figura 1B). La respuesta del tamaño corporal al aumento de la cantidad de nutrientes entre 0.5X y 1X no fue diferente entre los sexos (Figura 1 — figura del suplemento 1B) sin embargo, la respuesta del tamaño corporal al aumento de la cantidad de nutrientes entre 1X y 2X fue mayor en las mujeres que en los hombres (Figura 1 — suplemento de figura 1B). Es importante destacar que estos hallazgos no fueron específicos del volumen de la pupa, ya que reproducimos nuestros hallazgos utilizando el peso de los adultos como una lectura adicional del tamaño corporal (Figura 1A, B). Por lo tanto, nuestros hallazgos demuestran que, si bien la plasticidad fenotípica es similar entre los sexos en algunos contextos nutricionales, la plasticidad del tamaño corporal es mayor en las hembras que en los machos en un entorno rico en nutrientes.

Se requiere una regulación al alza de la actividad del IIS para aumentar la plasticidad del tamaño corporal dependiente de los nutrientes en las hembras con una dieta rica en proteínas.

(A) El peso de los adultos fue significativamente mayor en w 1118 machos y hembras cultivados en 1X en comparación con moscas criadas en 0.5X (p & lt0.0001 para ambos sexos ANOVA bidireccional seguido de la prueba Tukey HSD). La magnitud de este aumento en el peso adulto fue la misma en ambos sexos (interacción sexo: dieta p = 0.3197 ANOVA bidireccional seguido de la prueba Tukey HSD). El peso adulto fue significativamente mayor en w 1118 hembras criadas en 2X en comparación con las moscas cultivadas en 1X, sin embargo, el peso de los machos adultos no aumentó significativamente (p & lt0,0001 yp = 0,4015, respectivamente ANOVA bidireccional seguido de la prueba de Tukey HSD), donde el aumento dependiente de la dieta en el peso adulto fue mayor en las hembras (interacción sexo: dieta p = 0,0003 ANOVA bidireccional seguido de la prueba de Tukey HSD). (B) Normas de reacción para el peso adulto en respuesta a cambios en la cantidad de nutrientes en w 1118 hembras y machos, representados utilizando los datos presentados en el panel A. n = 6–11 grupos de 10 moscas. (C) El peso de los adultos fue significativamente mayor en las hembras cultivadas en 2Y en comparación con las moscas criadas en 1Y, sin embargo, el peso de los machos adultos no fue significativamente mayor en las moscas criadas en 2Y en comparación con los machos cultivados en 1Y (p & lt0,0001 yp = 0,7199, respectivamente de dos vías ANOVA seguido de la prueba de Tukey HSD, interacción sexo: dieta p & lt0.0001). (D) Normas de reacción para el peso adulto en w 1118 hembras y machos criados en 1Y o 2Y, representados usando datos del panel C. n = 7–11 grupos de 10 moscas. (mi) En las mujeres, los niveles de ARNm de los objetivos de Foxo (receptor de insulina (InR)brummer (bmm), y proteína de unión al factor de iniciación eucariota 4E (4E-BP)), fueron significativamente menores en las larvas criadas con una dieta rica en proteínas (2Y) en comparación con las larvas criadas con una dieta que contenía la mitad del contenido de proteínas (1Y) (p & lt0.0001 Student's t prueba). n = 8 repeticiones biológicas. (F) Cuantificación de la relación entre la proteína verde fluorescente (GFP) asociada a la membrana de la superficie celular y la GFP citoplásmica (relación GFP [M: C]) en un cuerpo graso disecado de larvas femeninas de la cepa GFP-PH. La proporción fue significativamente mayor en las larvas de hembras cultivadas en 2Y en comparación con las larvas criadas en 1Y (p = 0,001 Student's t prueba). n = 18 réplicas biológicas. (GRAMO) En los machos, no hubo diferencias significativas en los niveles de ARNm de los objetivos de Foxo entre las larvas criadas en 2Y en comparación con las larvas cultivadas en 1Y (p = 0,7323 Student's t prueba). n = 6–7 repeticiones biológicas. (H) En los machos, la relación M: C para GFP-PH no fue significativamente diferente entre los machos cultivados en 2Y en comparación con las larvas criadas en 1Y (p = 0.0892 Student's t prueba). n = 15-18 réplicas biológicas. (I) El volumen de la pupa fue significativamente mayor en ambos w 1118 hembras y InR E19 / + hembras criadas en 2Y en comparación con hembras con genotipo emparejado cultivadas en 1Y (p & lt0.0001 para ambos genotipos ANOVA bidireccional seguido de la prueba de Tukey HSD) sin embargo, la magnitud del aumento dependiente de nutrientes en el volumen de pupa fue menor en InR E19 / + hembras (genotipo: interacción de la dieta p & lt0.0001 ANOVA bidireccional seguido de la prueba de Tukey HSD). n = 58–77 pupas. (J) El volumen de la pupa fue significativamente mayor en ambos w 1118 machos y InR E19 / + machos criados en 2Y en comparación con machos con genotipo emparejado cultivados en 1Y (p & lt0.0001 para ambos genotipos ANOVA bidireccional seguido de la prueba de Tukey HSD). Mientras observamos una interacción sexo: dieta en el w 1118 genotipo de control, no hubo interacción sexo: dieta en el InR E19 / + genotipo (p & lt0.0001 yp = 0.7104, respectivamente ANOVA bidireccional seguido de la prueba Tukey HSD). n = 47–76 pupas. Para los gráficos de plasticidad del tamaño del cuerpo, los círculos rellenos indican el tamaño corporal medio y las líneas discontinuas indican el intervalo de confianza del 95%. *** indica p & lt0.001, **** indica p & lt0.0001 ns indica un error no significativo, las barras indican SEM.

Para reducir los macronutrientes que explican el aumento de la plasticidad del tamaño corporal en las mujeres, cambiamos los ingredientes alimentarios individuales y medimos el tamaño corporal en w 1118 masculinos y femeninos. Primero modificamos la levadura dietética, ya que estudios anteriores muestran que la levadura es una fuente clave de proteínas y un determinante importante del crecimiento larvario (Britton et al., 2002 Géminard et al., 2009 Robertson, 1963). En w 1118 hembras criadas con una dieta con un contenido de levadura que corresponde a la cantidad en la dieta 2X (dieta 2Y), el volumen de pupa fue significativamente mayor que en las hembras criadas con una dieta que contenía la mitad del contenido de levadura (1Y) (Figura 1 — figura del suplemento 1C) . Es importante señalar que el contenido de levadura y calorías de la dieta 1Y estuvo dentro del rango de las dietas estándar utilizadas en muchos estudios de crecimiento larvario (22,65 g / L frente a 21-46 g / L y 586 calorías / L frente a 459-760 calorías / L, respectivamente) (Ghosh et al., 2014 Koyama y Mirth, 2016 Marshall et al., 2012 Sawala y Gould, 2017), y por lo tanto no representa una dieta restringida en nutrientes. En w 1118 En los machos, la magnitud del aumento dependiente de nutrientes en el volumen de pupa fue menor que en las hembras (Figura 1 — figura del suplemento 1C interacción sexo: dieta p = 0,0001 Archivo suplementario 1), lo que sugiere que la plasticidad del tamaño corporal dependiente de los nutrientes fue mayor en las hembras en un contexto rico en levadura. De hecho, cuando graficamos las normas de reacción para el volumen de la pupa en ambos sexos, la magnitud del cambio dependiente de la levadura en el volumen de la pupa (Figura 1 — suplemento de la figura 1D) y el peso adulto (Figura 1C, D) fue mayor en las hembras que en los machos. Esta diferencia de sexo en la plasticidad fenotípica en un contexto rico en levadura se reprodujo en Cantón-S (CS), una cepa de tipo salvaje (Figura 1 — suplemento de figura 2A, B), y usando la longitud del ala como una medida adicional de tamaño (Figura 1 — suplemento de figura 3A). Por lo tanto, nuestros hallazgos indican que la diferencia entre hombres y mujeres en la plasticidad del tamaño corporal dependiente de los nutrientes persiste a través de múltiples antecedentes genéticos, y confirma que el tamaño corporal es un rasgo sólido para monitorear la plasticidad fenotípica dependiente de los nutrientes.

Dada la diferencia de sexo en la plasticidad del tamaño corporal en respuesta a la alteración del contenido de levadura, planteamos la hipótesis de que la levadura puede desencadenar una mayor plasticidad del tamaño corporal dependiente de los nutrientes en las hembras. Para probar esto, criamos larvas con dietas con azúcar alterada (Figura 1 — figura suplemento 4A) o contenido calórico (Figura 1 — figura suplemento 4B). Debido a que no observamos interacción sexo: dieta para ninguna de las manipulaciones (interacción sexo: dieta p = 0,6536 yp = 0,3698, respectivamente, archivo suplementario 1), esto sugiere que la levadura dietética media la diferencia de sexo en la plasticidad del tamaño corporal dependiente de los nutrientes. Para probar si la proteína es el macronutriente en la levadura que permite la plasticidad fenotípica específica del sexo, limitamos farmacológicamente la degradación de proteínas cultivando larvas en la dieta 2Y suplementada con un inhibidor de proteasa de amplio espectro (cóctel de inhibidores de proteasa PIC) o una serina proteasa específica. inhibidor (clorhidrato de fluoruro de 4- (2-aminoetil) bencenosulfonilo AEBSF). Estudios anteriores sugieren que estos inhibidores son específicos, ya que el efecto inhibidor del crecimiento de estos inhibidores de proteasa se amortiguó al alimentar a las larvas con bacterias que mejoran los niveles de ARNm de proteasa intestinal y la actividad proteolítica intestinal (Erkosar et al., 2015). Si bien encontramos una reducción significativa del tamaño corporal en ambos sexos tratados con inhibidores de proteasa (Figura 1 — figura suplemento 5A, B), en línea con estudios previos (Erkosar et al., 2015), la magnitud de la disminución inducida por inhibidores en pupa el volumen fue mayor en las larvas de hembras que en los machos (sexo: interacción de tratamiento p = 0,0029 [PIC] y p & lt0,0001 [AEBSF] Archivo suplementario 1). Esto indica que la proteína dietética derivada de la levadura es el macronutriente que aumenta la plasticidad del tamaño corporal dependiente de los nutrientes en las hembras. Si bien dos posibles explicaciones de la diferencia entre hombres y mujeres en la plasticidad del tamaño corporal son una diferencia de sexo en la ingesta de alimentos o la duración del período de crecimiento, no encontramos diferencias en ninguno de los fenotipos entre w 1118 larvas de machos y hembras cultivadas en 1Y o 2Y (Figura 1 — suplemento de figura 6A-C). Además, el tamaño corporal más grande de las larvas hembras no explica su mayor plasticidad del tamaño corporal dependiente de los nutrientes, ya que una manipulación genética que aumenta el tamaño corporal masculino no mejora la plasticidad fenotípica (Figura 1 — Suplemento de figura 7A, B). Tomados en conjunto, nuestros datos revelan que las larvas hembras han mejorado la plasticidad del tamaño corporal en un contexto rico en nutrientes e identifican la abundancia de proteínas en la dieta como un requisito previo para que las hembras maximicen el tamaño corporal.

La regulación positiva dependiente de nutrientes de la actividad de IIS en las mujeres es necesaria para lograr un tamaño corporal más grande en un contexto rico en proteínas.

En una población mixta de Drosophila larvas, la actividad de IIS está regulada positivamente por la disponibilidad de nutrientes para promover el crecimiento (Böhni et al., 1999 Britton et al., 2002 Chen et al., 1996 Fernandez et al., 1995 Grewal, 2009 Teleman, 2010). Por lo tanto, examinamos los cambios dependientes de nutrientes en la actividad de IIS en larvas criadas en 1Y y 2Y (Figura 1E-H). Estudios previos muestran que altos niveles de actividad de IIS reprimen los niveles de ARNm de varios genes a través del factor de transcripción Forkhead box, subgrupo O (Foxo FBgn0038197) (Alic et al., 2011 Jünger et al., 2003 Kang et al., 2017 Puig y Tjian, 2005 Zinke et al., 2002). Por lo tanto, evaluamos los niveles de ARNm de genes diana de Foxo conocidos. InR, brummer (bmm, FBgn0036449) y proteína de unión al factor de iniciación eucariota 4E (4E-BP, FBgn0261560) juntos para cuantificar la actividad de IIS en cada sexo y contexto dietético, un enfoque establecido para analizar genes corregulados (Blaschke et al., 2013 Hudry et al., 2019). En w 1118 En las hembras, los niveles de ARNm de los genes diana de Foxo fueron significativamente más bajos en las larvas criadas en 2Y que en las larvas criadas en 1Y (Figura 1E). Esto sugiere que la actividad de IIS es significativamente mayor en las hembras criadas en 2Y que en las hembras cultivadas en 1Y. Para confirmar esto, utilizamos la localización de una proteína fluorescente verde (GFP) expresada de manera ubicua fusionada con un dominio de homología de pleckstrina (PH) (GFP-PH) como una lectura adicional de la actividad de IIS. Debido a que los altos niveles de actividad de IIS aumentan la PIP de la membrana plasmática3, y los dominios PH se unen específicamente a PIP3, las larvas con elevada actividad de IIS muestran una mayor localización en la membrana de GFP-PH (Britton et al., 2002). Observamos una localización de membrana significativamente mayor de GFP-PH en hembras cultivadas en 2Y que en larvas de hembras criadas en 1Y (Figura 1F). Junto con el aumento de la represión del gen diana de Foxo en 2Y, estos datos de GFP-PH indican que las hembras criadas en 2Y tienen una mayor actividad de IIS que las hembras cultivadas en 1Y. En los machos, la magnitud del cambio dependiente de nutrientes en los genes diana de Foxo fue menor que en las hembras (Figura 1G), ya que detectamos una interacción significativa entre el sexo y la dieta para los genes diana de Foxo (p = 0.0007 Archivo suplementario 1). De hecho, no hubo un aumento significativo en la localización de la membrana GFP-PH entre los machos criados en 2Y y los machos criados en 1Y (Figura 1H). Tomados en conjunto, estos resultados revelan una regulación positiva de la actividad de IIS sesgada por las mujeres no reconocida previamente en un contexto rico en proteínas.

Para determinar si se requiere una mayor actividad de IIS en las hembras para poder maximizar el tamaño corporal con una dieta rica en proteínas, medimos el volumen de pupa en larvas heterocigotas para una mutación hipomórfica en el InR genInR E19 / +) que se criaron en 1 año o 2 años. Estudios anteriores han demostrado que, si bien el crecimiento general es en gran medida normal en InR E19 / + En los animales heterocigotos, el crecimiento que requiere altos niveles de actividad de IIS se reduce (Chen et al., 1996 Rideout et al., 2012 Rideout et al., 2015). En w 1118 control, las larvas cultivadas en 2Y fueron significativamente más grandes que las larvas criadas en 1Y (Figura 1I) sin embargo, la magnitud de este aumento dependiente de proteínas en el volumen de pupa fue menor en InR E19 / + hembras (Figura 1I genotipo: interacción dieta p & lt0.0001 archivo suplementario 1). Esto sugiere que la plasticidad del tamaño corporal dependiente de los nutrientes se redujo en InR E19 / + hembras. De hecho, aunque observamos una diferencia de sexos en la plasticidad fenotípica en el w 1118 genotipo de control (interacción sexo: dieta pag& lt0.0001 Archivo suplementario 1), la diferencia de sexo en la plasticidad del tamaño corporal dependiente de los nutrientes fue abolida en el InR E19 / + genotipo (Figura 1I, J sexo: interacción dieta p = 0,7104 Archivo suplementario 1). Juntos, estos resultados indican que la regulación al alza dependiente de nutrientes de la actividad del IIS en las mujeres es necesaria para que logren un tamaño corporal más grande en un contexto rico en proteínas, y que la diferencia de sexo en la plasticidad del tamaño corporal surge de la regulación al alza sesgada por las mujeres de Actividad de IIS en un contexto rico en proteínas.

dilp2 es necesario para la regulación positiva dependiente de nutrientes de la actividad de IIS y un tamaño corporal más grande en hembras criadas con una dieta rica en proteínas.

Estudios anteriores han identificado cambios en la producción y liberación de Dilps como importantes mecanismos subyacentes a los cambios dependientes de nutrientes en la actividad del IIS y el tamaño corporal (Colombani et al., 2003 Géminard et al., 2009 Zhang et al., 2009). Por ejemplo, los niveles de ARNm de Péptido 3 similar a la insulina de Drosophila (dilp3 FBgn0044050) y Péptido 5 similar a la insulina de Drosophila (dilp5 FBgn0044048), pero no dilp2, disminución en respuesta a la abstinencia de nutrientes (Colombani et al., 2003 Géminard et al., 2009 Ikeya et al., 2002), y la liberación de Dilps 2, 3 y 5 de los IPC se ve alterada por cambios en la disponibilidad de nutrientes ( Géminard et al., 2009 Kim y Neufeld, 2015). Los niveles de Dilp2 también fluctúan durante el desarrollo larvario (Slaidina et al., 2009). Curiosamente, un estudio reciente sugiere que las larvas hembras del tercer estadio tardío han aumentado la secreción de Dilp2 en comparación con los machos de la misma edad cuando las larvas se criaron con una dieta equivalente a 2Y (Rideout et al., 2015). Dado que Dilp2 es un Dilp importante que promueve el crecimiento (Grönke et al., 2010 Ikeya et al., 2002), probamos si dilp2 se requirió en las hembras para la regulación positiva dependiente de nutrientes de la actividad de IIS. En control w 1118 En las hembras, los niveles de ARNm de los genes diana de Foxo fueron significativamente más bajos en las larvas criadas en 2Y que en las larvas criadas en 1Y (Figura 2A), lo que sugiere un aumento dependiente de nutrientes en la actividad de IIS. Por el contrario, los niveles de ARNm de los genes diana de Foxo no fueron significativamente más bajos en dilp2 larvas de hembras mutantes criadas en 2Y en comparación con hembras de genotipo emparejadas cultivadas en 1Y (Figura 2A), lo que sugiere que la pérdida de dilp2 en las hembras eliminó el aumento dependiente de nutrientes en la actividad de IIS. La magnitud de la disminución dependiente de nutrientes en la expresión del gen diana de Foxo fue menor en w 1118 hombres en comparación con w 1118 mujeres (Figura 2B, interacción sexo: dieta p = 0.0511 Archivo complementario 1), pero no en dilp2 machos mutantes en comparación con hembras de genotipo emparejado (sexo: interacción dieta p = 0,6754 Archivo suplementario 1). Esto indica que dilp2 La pérdida bloquea la regulación positiva de la actividad de IIS, sesgada por las mujeres, en una dieta rica en proteínas.

Drosophila El péptido 2 similar a la insulina es necesario para la regulación al alza dependiente de nutrientes de la actividad de la vía de la insulina y el aumento de la plasticidad del tamaño del cuerpo femenino.

(A) En control w 1118 hembras, niveles de ARNm de los objetivos de Foxo (receptor de insulina (InR)brummer (bmm), y proteína de unión al factor de iniciación eucariota 4E (4E-BP)), fueron significativamente menores en las larvas cultivadas con una dieta rica en proteínas (2Y) en comparación con las larvas criadas con una dieta que contenía la mitad de la proteína (1Y) (p & lt0.0001 Student's t prueba). En dilp2 hembras mutantes, no hubo diferencia significativa en los niveles de ARNm de los objetivos de Foxo en las larvas cultivadas en 2Y en comparación con las larvas criadas en 1Y (p = 0,2231 Student's t prueba). n = 8 repeticiones biológicas. (B) En control w 1118 y dilp2 En los machos mutantes, los niveles de ARNm de los objetivos de Foxo fueron significativamente más bajos en las larvas cultivadas en 2Y en comparación con las larvas criadas en 1Y (p = 0,0066 yp = 0,0023 respectivamente. t prueba). n = 7-8 réplicas biológicas, sin embargo, la magnitud de la reducción en la expresión del gen diana de Foxo en w 1118 los machos eran más pequeños que en las hembras del mismo genotipo. (C) El peso de los adultos fue significativamente mayor en w 1118 hembras criadas en 2Y en comparación con moscas cultivadas en 1Y (p & lt0.0001 ANOVA bidireccional seguido de la prueba Tukey HSD) sin embargo, el peso adulto no fue significativamente diferente entre dilp2 hembras mutantes criadas en 2Y versus 1Y (p = 0.1263 ANOVA bidireccional seguido de la prueba Tukey HSD). n = 7–11 grupos de 10 moscas. (D) Peso adulto bajo control w 1118 y dilp2 los machos mutantes no fue significativamente mayor en las moscas criadas en 2Y en comparación con los machos criados en 1Y (p = 0.8366 yp = 0.8817, respectivamente ANOVA bidireccional seguido de la prueba Tukey HSD). Hubo una interacción significativa entre el sexo y la dieta en el grupo de control. w 1118 genotipo (p & lt0.0001), pero no en el dilp2 genotipo mutante (p = 0,0827 ANOVA bidireccional seguido de la prueba de Tukey HSD). n = 10-12 grupos de 10 moscas. (mi) El volumen de la pupa fue significativamente mayor en w 1118 hembras pero no en dilp2 hembras mutantes criadas en 2Y en comparación con hembras con genotipo emparejado cultivadas en 1Y (p & lt0,0001 yp = 0,6486 respectivamente ANOVA bidireccional seguido de la prueba de Tukey HSD). La magnitud del aumento dependiente de nutrientes en el volumen de pupa fue mayor en w 1118 hembras (genotipo: interacción de la dieta p & lt0.0001 ANOVA bidireccional seguido de la prueba de Tukey HSD). n = 74-171 pupas. (F) El volumen de pupa fue significativamente mayor en w 1118 machos y dilp2 machos mutantes criados en 2Y en comparación con machos con genotipo emparejado cultivados en 1Y (p & lt0.0001 para ambos genotipos ANOVA bidireccional seguido de la prueba de Tukey HSD). La magnitud del aumento dependiente de nutrientes en el volumen de pupa no fue diferente entre los genotipos (interacción genotipo: dieta p = 0.6891 ANOVA de dos vías seguido de la prueba de Tukey HSD). n = 110-135 pupas. (GRAMO) El volumen de la pupa se redujo significativamente en las hembras tras la caída mediada por ARNi de dilp2 en 2Y en comparación con ambos genotipos de control (p & lt0.0001 [da& gt +] y p = 0,002 [+ & gtUAS-dilp2-RNAi], respectivamente ANOVA bidireccional seguido de la prueba de Tukey HSD), pero no en hombres en 2Y (p & lt0,0001 [da& gt +] y 0.9634 [+ & gtUAS-dilp2-RNAi], ANOVA bidireccional respectivamente seguido de la prueba de Tukey HSD). La magnitud del efecto de la caída mediada por RNAi de dilp2 el volumen de pupa fue mayor en las hembras (sexo: interacción genotipo p = 0,003 ANOVA bidireccional seguido de la prueba de Tukey HSD). n = 44–59 pupas. Para todos los gráficos de plasticidad de tamaño corporal, los círculos rellenos indican el tamaño corporal medio y las líneas discontinuas indican un intervalo de confianza del 95%. ** indica p & lt0.01, **** indica p & lt0.0001 ns indica un error no significativo, las barras indican SEM.

Para determinar si la incapacidad de aumentar la actividad de IIS en 2Y afecta el aumento dependiente de nutrientes en el tamaño corporal de la mujer, medimos el tamaño corporal en w 1118 y dilp2 larvas mutantes cultivadas en 1Y o 2Y. En w 1118 control, el peso adulto fue significativamente mayor en las moscas cultivadas en 2Y en comparación con las moscas criadas en 1Y (Figura 2C) sin embargo, este aumento dependiente de nutrientes en el peso adulto no se observó en dilp2 hembras mutantes (Figura 2C genotipo: interacción dieta p = 0,0024 Archivo suplementario 1). En w 1118 controlar a los machos y dilp2 machos mutantes, no hubo un aumento significativo en el peso adulto en las moscas criadas en 2Y en comparación con las moscas del mismo genotipo cultivadas en 1Y (Figura 2D genotipo: interacción de la dieta p = 0,935 Archivo suplementario 1). De hecho, en contraste con la diferencia de sexo en la plasticidad del tamaño corporal dependiente de los nutrientes en el w 1118 genotipo (sexo: interacción dieta p & lt0.0001 archivo suplementario 1), la diferencia de sexo en la plasticidad fenotípica fue abolida en el dilp2 genotipo mutante (interacción sexo: dieta p = 0,0827 Archivo complementario 1). Es importante destacar que replicamos todos estos hallazgos utilizando el volumen de pupa (Figura 2E, F), reproducimos los efectos específicos de las hembras de dilp2 pérdida al sobreexpresar globalmente un UAS-dilp2-RNAi transgén (Figura 2G), y muestra que dilp2 la pérdida no altera el comportamiento de alimentación (Figura 2 — figura suplementaria 1A). Si bien no determinamos una diferencia de sexo en los niveles circulantes de Dilp2 en larvas con una etiqueta endógena dilp2 alelo debido a defectos de plasticidad del tamaño corporal en esta cepa (Park et al., 2014 Figura 2 — figura suplemento 2A, B), un experimento que será importante repetir en el futuro utilizando formas alternativas de medir la Dilp2 circulante, mostramos que los cambios en dilp Niveles de ARNm en hombres y mujeres que carecen dilp2 (Figura 2 — figura del suplemento 3A, B) y cambios dependientes de los nutrientes en dilp Los niveles de ARNm (Figura 2 - figura del suplemento 4A, B) fueron similares en ambos sexos. Juntos, nuestros datos revelan un requisito específico de mujeres no reconocido previamente para dilp2 para desencadenar un aumento dependiente de nutrientes en la actividad de IIS y el tamaño corporal en un contexto rico en proteínas.

Un aumento dependiente de nutrientes en enano Se requieren niveles de ARNm para mejorar la actividad de IIS y un tamaño corporal más grande en hembras cultivadas con una dieta rica en proteínas.

Los cambios dependientes de nutrientes en la secreción de Dilp de los IPC y, en consecuencia, la actividad de IIS, están mediados por factores humorales que están regulados por los nutrientes de la dieta (Britton y Edgar, 1998 Delanoue et al., 2016 Koyama y Mirth, 2016 Rajan y Perrimon, 2012 Rodenfels et al., 2014 Sano et al., 2015). Por ejemplo, en una población de larvas de distintos sexos, la proteína de la dieta aumenta los niveles de ARNm de Péptidos bloqueadores del crecimiento 1 y 2 (Gbp1, FBgn0034199 Gbp2, FBgn0034200), CCHamida-2 (CCHa2 FBgn0038147), no emparejado 2 (upd2 FBgn0030904) y sol (Delanoue et al., 2016 Koyama y Mirth, 2016 Rajan y Perrimon, 2012 Sano et al., 2015). Los niveles elevados de estos factores humorales promueven la secreción de Dilps producidos por IPC para mejorar la actividad y el crecimiento de IIS (Delanoue et al., 2016 Koyama y Mirth, 2016 Meschi et al., 2019 Rajan y Perrimon, 2012 Sano et al., 2015) . Para determinar si algún factor humoral contribuye al aumento sesgado por el sexo en la actividad de IIS en una dieta rica en proteínas, examinamos los niveles de ARNm de cada factor en larvas de ambos sexos criadas en 1Y o 2Y. En w 1118 hembras sol Los niveles de ARNm en las larvas criadas en 2Y fueron significativamente más altos que en las larvas cultivadas en 1Y (Figura 3A). Por el contrario, los niveles de ARNm de Gbp1, Gbp2, CCHa2, y upd2 no fueron significativamente mayores en las larvas hembras criadas en 2Y en comparación con 1Y (Figura 3B). Por lo tanto, mientras que estudios anteriores han demostrado que los niveles de ARNm de todos los factores humorales se redujeron severamente por una dieta restringida en nutrientes o la abstinencia de nutrientes (Delanoue et al., 2016 Koyama y Mirth, 2016 Rajan y Perrimon, 2012 Sano et al., 2015) , nuestro estudio sugiere que para la mayoría de los factores, aumentar las proteínas de la dieta más allá de un nivel ampliamente utilizado no mejora aún más los niveles de ARNm. En los hombres, no hubo un aumento significativo en sol Niveles de ARNm (Figura 3C), o cualquier otro factor humoral (Figura 3D), en larvas criadas en 2Y en comparación con 1Y. Por lo tanto, existe una diferencia de sexo no reconocida previamente en la regulación de sol Niveles de ARNm en un contexto rico en proteínas, lo que confirmamos que conduce a una diferencia de sexo en los niveles circulantes del Sol (Figura 3 — Suplemento de figura 1A).

Enano es necesario para la regulación positiva dependiente de los nutrientes de la actividad de la vía de la insulina y el aumento de la plasticidad del tamaño del cuerpo femenino.

(A) En las mujeres, los niveles de ARNm de enano (sol) REAL ACADEMIA DE BELLAS ARTES , pero no sol RB fueron significativamente más altas en las larvas cultivadas con una dieta rica en proteínas (2Y) en comparación con las larvas criadas con una dieta que contiene la mitad de la proteína (1Y) (p = 0,0055 yp = 0,2327, respectivamente Student's t prueba). n = 8 repeticiones biológicas. (B) niveles de ARNm de Péptido bloqueador del crecimiento 1 (Gbp1) fueron significativamente diferentes en las hembras cultivadas en 2Y en comparación con las hembras criadas en 1Y (p = 0.0245 Student's t prueba) sin embargo, los niveles de ARNm de Péptido bloqueador del crecimiento 2 (Gbp2), CCHamida-2 (CCHa2), y no emparejado 2 (upd2) no fueron significativamente diferentes entre las larvas de hembras criadas en 1Y y 2Y (p = 0.0662, 0.1416 y 0.7171, respectivamente Student's t prueba). n = 7-8 repeticiones biológicas. (C) En los hombres, los niveles de ARNm de sol RA y sol RB no fueron significativamente diferentes en las larvas criadas en 2Y en comparación con las larvas criadas en 1Y (p = 0.5832 yp = 0.2017, respectivamente Student's t prueba). n = 7-8 repeticiones biológicas. (D) Niveles de Gbp1 y upd2 no fueron significativamente diferentes entre las larvas macho criadas en 2Y en comparación con las larvas criadas en 1Y (p = 0.1487 yp = 0.1686, respectivamente Student's t prueba) mientras que los niveles de Gbp2 y CCHa2 fueron significativamente diferentes entre los hombres criados en 2Y y 1Y (p = 0.0214, yp = 0.0272, respectivamente Student's t prueba). n = 7-8 repeticiones biológicas. (mi) En control r4 & gt +, y + & gtsun-RNAi hembras, niveles de ARNm de los objetivos de Foxo (receptor de insulina (InR)brummer (bmm), y proteína de unión al factor de iniciación eucariota 4E (4E-BP)), fueron significativamente menores en las larvas cultivadas en 2Y en comparación con las larvas criadas en 1Y (p & lt0.0001, para ambas comparaciones Student's t prueba). Sin embargo, en r4 y gtsun-RNAi mujeres, no hubo diferencias significativas en los niveles de ARNm diana de Foxo (p = 0.2792 Student's t prueba). n = 8 repeticiones biológicas. (F) En control r4 & gt +, y + & gtsun-RNAi En los machos, los niveles de ARNm de los objetivos de Foxo fueron significativamente más bajos en las larvas cultivadas en 2Y en comparación con las larvas criadas en 1Y (p & lt0,0001 yp = 0,0001, respectivamente Student's t prueba). Tiempo r4 y gtsun-RNAi los hombres no mostraron diferencias significativas en los niveles de ARNm diana de Foxo (p = 0.2469 Student's t prueba), no hubo interacción genotipo: dieta entre los machos (p = 0,1068), lo que sugiere que el genotipo no tuvo impacto en los genes diana de Foxo. Es importante destacar que hubo una interacción significativa entre el sexo y la dieta para los niveles de ARNm diana de Foxo tanto en r4 y gt + control (p = 0.0166 ANOVA bidireccional seguido de la prueba Tukey HSD) y + & gtsun-RNAi control (p = 0.0119 ANOVA bidireccional seguido de la prueba Tukey HSD), pero no en r4 y gtsun-RNAi larvas (p = 0,1121 ANOVA de dos vías seguido de la prueba de Tukey HSD). n = 7-8 repeticiones biológicas. (GRAMO) El peso de los adultos fue significativamente mayor en las hembras criadas en 2 años en comparación con las hembras criadas en 1 año en r4 y gt + y + & gtUAS-sun-RNAi controles (p & lt0.0001 para ambos genotipos ANOVA bidireccional seguido de la prueba Tukey HSD) sin embargo, el peso adulto no fue significativamente diferente entre r4 y gtUAS-sun-RNAi hembras criadas en 2Y en comparación con hembras con genotipo emparejado criadas en 1Y (p = 0.5035 ANOVA bidireccional seguido de la prueba Tukey HSD). n = 7–10 grupos de 10 moscas. (H) El peso adulto no fue significativamente mayor en los machos criados en 2Y en comparación con los machos cultivados en 1Y para r4 y gt + y + & gtUAS-sun-RNAi controles o r4 y gtUAS-sun-RNAi hombres (p = 0,8883, 0,6317 y 0,554, respectivamente ANOVA bidireccional seguido de la prueba de Tukey HSD). Hubo una interacción significativa entre el sexo y la dieta en el r4 y gt + y + & gtUAS-sun-RNAi genotipos de control (p = 0.011 yp = 0.0005, respectivamente ANOVA bidireccional seguido de la prueba de Tukey HSD), pero sin interacción sexo: dieta en el r4 y gtUAS-sun-RNAi genotipo (p = 0,8749 ANOVA de dos vías seguido de la prueba de Tukey HSD). n = 6–9 grupos de 10 moscas. Para todos los gráficos de plasticidad de tamaño corporal, los círculos rellenos indican el tamaño corporal medio y las líneas discontinuas indican un intervalo de confianza del 95%. * indica p & lt0.05, ** indica p & lt0.01, *** indica p & lt0.001 **** indica p & lt0.0001 ns indica error no significativo, las barras indican SEM.

Dado que una serie completa de experimentos de cocultivo genético, molecular y de órganos ha establecido que Sun promueve la actividad de IIS al mejorar la secreción de Dilp2 (Delanoue et al., 2016), planteamos la hipótesis de que el aumento específico de la mujer en sol Los niveles de ARNm en 2Y desencadenan la regulación al alza dependiente de nutrientes de la actividad de IIS en las hembras. Para probar esto, sobreexpresamos UAS-sun-RNAi en el cuerpo graso larvario usando r4-GAL4y cultivó los animales en 1Y o 2Y. Es importante destacar que la sobreexpresión de la UAS-sol-ARNi transgén disminuyó significativamente sol Niveles de ARNm en ambos sexos (Figura 3 — figura suplemento 2A, B), donde la expresión de GAL4 fue similar entre los sexos en 1Y y 2Y (figura 3 — figura suplemento 2C). En control r4 y gt + y + & gtUAS-sun-RNAi hembras, observamos una disminución significativa en la expresión del gen diana de Foxo en las larvas cultivadas en 2Y en comparación con las larvas de genotipo emparejadas criadas en 1Y (Figura 3E). Por el contrario, la disminución dependiente de nutrientes en la expresión del gen diana de Foxo estuvo ausente en r4 y gtUAS-sun-RNAi hembras (Figura 3E dieta: interacción genotipo p & lt0.0001 Archivo suplementario 1), lo que sugiere sol se requiere en las hembras para el aumento dependiente de nutrientes en la actividad de IIS. En los machos, la magnitud de la disminución dependiente de nutrientes en la expresión del gen diana de Foxo fue menor que en las hembras de genotipo emparejado para el r4 y gt + y + & gtUAS-sun-RNAi cepas de control (p = 0.0166 [r4 y gt +] p = 0,0119 [+ & gtUAS-sun-RNAi] Archivo suplementario 1), pero no en el r4 y gtUAS-sun-RNAi cepa (Figura 3F) (interacción sexo: dieta p = 0.1121 [r4 y gtUAS-sun-RNAi] Archivo complementario 1). Es importante destacar que la falta de una interacción dieta: genotipo entre los machos indica que no hubo ningún efecto del genotipo en la expresión del gen diana de Foxo (p = 0.1068 Archivo suplementario 1). Juntos, estos datos sugieren que en las mujeres una dieta rica en proteínas estimula un aumento dependiente de nutrientes en sol ARNm que promueve la actividad de IIS. En los hombres, la dieta 2Y no aumentó sol Niveles de ARNm, lo que sugiere una razón para el aumento de la actividad de IIS en una dieta rica en proteínas, sesgada por las mujeres.

A continuación preguntamos si el aumento específico de mujeres en sol El ARNm y su impacto en la actividad de IIS contribuyen al aumento dependiente de nutrientes en el tamaño del cuerpo femenino en un contexto rico en proteínas. En r4 y gt + y + & gtUAS-sun-RNAi En las hembras de control, el peso adulto fue significativamente mayor en las moscas cultivadas en 2Y en comparación con las moscas del mismo genotipo criadas en 1Y (Figura 3G). Por el contrario, el aumento de peso de los adultos dependiente de nutrientes se abolió en r4 y gtUAS-sun-RNAi hembras (Figura 3G genotipo: interacción dieta p = 0,0014 Archivo suplementario 1). Esto indica r4 y gtUAS-sun-RNAi las hembras tienen una plasticidad reducida del tamaño corporal dependiente de los nutrientes, un hallazgo que no puede explicarse por los cambios en el comportamiento de alimentación (Figura 3 - Figura 3A). En r4 y gt +, + & gtUAS-sun-RNAi, y r4 y gtUAS-sun-RNAi moscas macho criadas en 2Y, el peso adulto no fue significativamente mayor que en los machos de genotipo emparejado criados en 1Y (Figura 3H genotipo: interacción dieta p = 0.9278 Archivo suplementario 1). Es importante destacar que, en contraste con la diferencia de sexo en la plasticidad del tamaño corporal dependiente de los nutrientes que observamos en el r4 y gt + y + & gtUAS-sun-RNAi genotipos de control (interacción sexo: dieta p = 0.011 yp=0,0005, respectivamente archivo suplementario 1), la diferencia de sexos en la plasticidad fenotípica fue abolida en el r4 y gtUAS-sun-RNAi genotipo (interacción sexo: dieta p = 0,8749 archivo suplementario 1), resultados que reproducimos utilizando el volumen de pupa (Figura 3 — suplemento de figura 4A, B). Si bien no observamos efectos de plasticidad fenotípica en larvas con pérdida del receptor solar de todo el cuerpo, panneuronal o IPC Matusalén (mes Fbgn0023000 Delanoue et al., 2016 Figura 3 (suplemento de figura 5A-F), probablemente debido al uso de diferentes dilp2-GAL4 líneas, variación menor en las condiciones de cría y defectos de plasticidad específicos del sexo en el dilp2-GAL4 cepa, reproducimos los efectos específicos de la hembra de sol reducción del tamaño corporal utilizando una línea adicional de grasa corporal GAL4 (Figura 3 — suplemento de figura 6A). Además, mostramos que este papel para sol en mediar el aumento dependiente de nutrientes en el tamaño del cuerpo femenino en un contexto rico en proteínas es único para sol, ya que ningún otro factor humoral causó efectos específicos del sexo sobre el tamaño corporal (Figura 3 — suplemento de figura 6B, C).

Nuestros datos sugieren un modelo en el que el aumento dependiente de nutrientes en sol Los niveles de ARNm son una razón importante por la que las mujeres criadas en un contexto rico en proteínas tienen un tamaño corporal más grande. Para determinar si aumentó sol Los niveles de ARNm podrían aumentar el tamaño corporal, sobreexpresamos sol específicamente en el cuerpo graso en larvas de cada sexo criadas en 1 año y 2 años. Encontramos ese cuerpo gordo sol la sobreexpresión fue suficiente para aumentar el tamaño corporal en ambos sexos, tanto en la dieta 1Y como en la 2Y (Figura 3 — suplemento de figura 7A, B). Esto demuestra que aumentó sol Los niveles de ARNm son suficientes para mejorar el tamaño corporal en estos contextos. Si bien este hallazgo contrasta con los datos de un estudio anterior que utilizó una dieta diferente y un grupo experimental mixto (Delanoue et al., 2016), cuando replicamos sus condiciones experimentales, encontramos un aumento significativo en el tamaño corporal que se oscureció al combinar los datos. de machos y hembras (Figura 3 — suplemento de figura 8A, B). Juntos, estos datos respaldan un modelo en el que el aumento de grasa corporal sol Los niveles de ARNm mejoran el tamaño corporal en múltiples contextos nutricionales, un efecto que antes se pasaba por alto debido a una pequeña variación entre las dietas de laboratorio y el uso de un grupo experimental mixto. Es importante señalar, sin embargo, que a pesar del tamaño corporal más grande de sol-sobreexpresando machos y hembras, la plasticidad fenotípica no se incrementó en el sol-Larvas que sobreexpresan (Figura 3 — figura del suplemento 7A, dieta B: interacción del genotipo p = 0,4959 yp = 0,0895, respectivamente, archivo suplementario 1). Es probable que esto se deba al hecho de que el aumento dependiente de nutrientes en sol Los niveles de ARNm todavía estaban ausentes en el contexto de sol sobreexpresión en los hombres (Figura 3 — figura del suplemento 8C), como sugiere nuestro modelo, es la capacidad de regular al alza sol ARNm en respuesta a la proteína de la dieta, en lugar de absoluta sol Niveles de ARNm, que permiten a las hembras criadas con una dieta rica en proteínas alcanzar un tamaño corporal más grande.

Gen de determinación del sexo transformador promueve la plasticidad del tamaño corporal dependiente de los nutrientes en las hembras

Para obtener una comprensión más completa de la diferencia de sexo en la plasticidad fenotípica, queríamos identificar factores genéticos en las hembras que confieren la capacidad de regular al alza sol Niveles de ARNm en respuesta a la proteína de la dieta. Un candidato era el gen de determinación del sexo. tra, como tra anteriormente se descubrió que afectaba la actividad de IIS y el tamaño corporal en una dieta equivalente a 2Y (Rideout et al., 2015 Mathews et al., 2017). Por lo tanto, realizamos estudios de pérdida y ganancia de función con tra y supervisó los cambios en la actividad de IIS, sol ARNm y tamaño corporal en las dietas 1Y y 2Y. En control w 1118 hembras, la expresión del gen diana de Foxo fue significativamente menor en las larvas criadas en 2Y en comparación con las larvas cultivadas en 1Y (Figura 4A) sin embargo, esta disminución dependiente de nutrientes en la expresión del gen diana de Foxo se abolió en tra hembras mutantestra 1 / Df (3L) st-j7) (Figura 4A dieta: interacción genotipo p = 0.0081 Archivo suplementario 1). Del mismo modo, mientras sol Niveles de ARNm en w 1118 las hembras de control fueron significativamente más altas en larvas criadas en 2Y en comparación con 1Y (Figura 4B), este aumento dependiente de nutrientes en sol Los niveles de ARNm estaban ausentes en tra hembras mutantes (Figura 4B). Esto indica que tra se requiere en las hembras para el aumento dependiente de nutrientes en sol Niveles de ARNm y actividad de IIS en un contexto rico en proteínas.

Gen de determinación del sexo transformador (tra) regula el aumento de la plasticidad del tamaño corporal dependiente de los nutrientes en las hembras.

(A) En control w 1118 hembras, niveles de ARNm de los objetivos de Foxo (receptor de insulina (InR)brummer (bmm), y proteína de unión al factor de iniciación eucariota 4E (4E-BP)), fueron significativamente menores en las larvas cultivadas con una dieta rica en proteínas (2Y) en comparación con las larvas criadas con una dieta que contenía la mitad de la proteína (1Y) (p = 0,0057 Student's t prueba). En tra mutantetra 1 / Df (3L) st-j7) hembras, no hubo diferencias significativas en los niveles de ARNm de los objetivos de Foxo en las larvas cultivadas en 2Y en comparación con las larvas criadas en 1Y (p = 0,2291 Student's t prueba). n = 8 repeticiones biológicas. (B) En las hembras de control, los niveles de ARNm de sol RA fueron significativamente mayores en las larvas cultivadas en 2Y en comparación con las larvas criadas en 1Y (p = 0,0011 Student's t prueba) sin embargo, en tra 1 /Df (3L) st-j7 mujeres no hubo diferencia significativa en sol RA Niveles de ARNm entre larvas cultivadas en 2Y en comparación con larvas criadas en 1Y (p = 0,1644 Student's t prueba). n = 8 repeticiones biológicas. (C) El peso de los adultos fue significativamente mayor en w 1118 hembras criadas en 2 años en comparación con hembras criadas en 1 año (p & lt0.0001 ANOVA bidireccional seguido de la prueba de Tukey HSD) sin embargo, no hubo diferencia significativa en el peso adulto entre tra 1 /Df (3L) st-j7 hembras cultivadas en 2Y en comparación con hembras con genotipo apareado criadas en 1Y (p = 0,9617 ANOVA bidireccional seguido de la prueba de Tukey HSD). n = 7-8 grupos de 10 moscas. (D) El peso adulto no fue significativamente mayor en ninguno w 1118 control o tra 1 /Df (3L) st-j7 machos mutantes en moscas criadas en 2Y en comparación con machos criados en 1Y (p = 0,7808 yp = 0,9983, respectivamente ANOVA bidireccional seguido de la prueba de Tukey HSD). Hubo una interacción significativa entre el sexo y la dieta en el w 1118 genotipo de control (p & lt0.0001 ANOVA de dos vías seguido de la prueba de Tukey HSD) sin embargo, no hubo interacción sexo: dieta en el tra 1 /Df (3L) st-j7 genotipo (p = 0,6598 ANOVA de dos vías seguido de la prueba de Tukey HSD). n = 6–8 grupos de 10 moscas. (mi) En control da & gt +, y + & gttra F En los machos, los niveles de ARNm de los objetivos de Foxo fueron significativamente más altos en las larvas cultivadas en 2Y en comparación con las larvas criadas en 1Y con una dieta que contenía la mitad del contenido de proteína (1Y) (p = 0.0108 yp & lt0.0001, respectivamente. t prueba). Sin embargo, en da & gttra F hombres, hubo una disminución significativa en los niveles de ARNm diana de Foxo (p & lt0.0001 Student's t prueba). n = 8 repeticiones biológicas. Es importante destacar que hubo una interacción significativa entre el sexo y la dieta para los niveles de ARNm diana de Foxo tanto en da & gt + control (p = 0.0004 ANOVA bidireccional seguido de la prueba Tukey HSD) y + & gttra F control (p & lt0.0001 ANOVA bidireccional seguido de la prueba Tukey HSD), pero no en da & gttra F larvas (p = 0,3095 ANOVA de dos vías seguido de la prueba de Tukey HSD). n = 7-8 repeticiones biológicas. (F) En control da & gt + y + & gtUAS-tra F machos, niveles de ARNm de sol RA no fueron significativamente diferentes entre las larvas cultivadas en 2Y en comparación con las larvas criadas en 1Y (p = 0,2064 yp = 0,0711, respectivamente Student's t prueba). A diferencia de, da & gtUAS-tra F Los machos mostraron un aumento significativo en los niveles de ARNm de sol RA en larvas cultivadas en 2Y en comparación con machos criados en 1Y (p = 0,0013 Student's t prueba). n = 6–8 repeticiones biológicas. (GRAMO) El peso adulto no fue significativamente mayor en da& gt + y + & gtUAS-tra F machos de control criados en 2Y en comparación con moscas machos de genotipo emparejados cultivadas en 1Y (p = 0.5186 yp = 0.8858, respectivamente ANOVA bidireccional seguido de la prueba Tukey HSD) sin embargo, hubo un aumento significativo en el peso adulto entre da & gtUAS-tra F machos cultivados en 2Y en comparación con moscas del mismo genotipo criadas en 1Y (ANOVA bidireccional p & lt0.0001 seguido de la prueba de Tukey HSD). n = 7-8 grupos de 10 moscas. (H) El peso de los adultos fue significativamente mayor en r4-GAL4 controlar a los machos con tra F K-IN , que expresan niveles fisiológicos de una proteína Tra funcional, cuando se crían en 2Y en comparación con 1Y ((p & lt0,0001 [r4, Df (3L) st-j7 / tra F K-IN ]) ANOVA bidireccional seguido de la prueba de Tukey HSD). Por el contrario, el aumento de peso de un adulto dependiente de los nutrientes se eliminó tras la caída del cuerpo graso de sol en un tra F K-IN hombre ((p = 0,9915 [UAS-sun-RNAi / + r4, Df (3L) st-j7 / tra F K-IN ]) ANOVA bidireccional seguido de la prueba de Tukey HSD). El peso adulto no fue diferente en tra mutante r4-GAL4 los hombresr4, Df (3L) st-j7 / tra KO ) criados en 2Y en comparación con machos del mismo genotipo cultivados en 1Y (p = 0,9980 ANOVA bidireccional seguido de la prueba Tukey HSD). El peso adulto no se redujo en 1 año con la caída del cuerpo graso de sol en un tra macho mutanteUAS-sol-ARNi / + r4, Df (3L) st-j7 / tra KO ) (p = 0,9998 [UAS-sol-ARNi / + r4, Df (3L) st-j7 / tra KO v r4, Df (3L) st-j7 / tra KO ]) ANOVA bidireccional seguido de la prueba de Tukey HSD). n = 9-11 grupos de 10 moscas. Para todos los gráficos de plasticidad de tamaño corporal, los círculos rellenos indican el tamaño corporal medio y las líneas discontinuas indican un intervalo de confianza del 95%. * indica p & lt0.05, ** indica p & lt0.01, **** indica p & lt0.0001 ns indica un error no significativo, las barras indican SEM.

Para determinar si la falta de tra también afecta la plasticidad del tamaño corporal dependiente de los nutrientes, medimos el tamaño corporal en w 1118 controles y tra mutantes criados en 1Y y 2Y. En control w 1118 hembras, el peso adulto fue significativamente mayor en las moscas criadas en 2Y en comparación con las moscas cultivadas en 1Y (Figura 4C) sin embargo, este aumento dependiente de nutrientes en el peso adulto se bloqueó en tra hembras mutantes (figura 4C genotipo: interacción dieta p & lt0.0001 archivo suplementario 1), un hallazgo que reproducimos usando el volumen de pupa (figura 4 — figura suplementaria 1A). Dado que confirmamos este resultado utilizando un tra alelo mutantetra KO ) (Hudry et al., 2016 Figura 4 — figura suplemento 1B), y que este hallazgo no puede explicarse por cambios en la ingesta de alimentos (figura 4 — figura suplemento 1C), esto indica que tra las hembras mutantes tienen una plasticidad del tamaño corporal dependiente de los nutrientes reducida en comparación con las hembras de control (genotipo: interacción de la dieta p & lt0.0001 [tra 1 / Df (3L) st-j7] p& lt0.0001 [tra KO ] Archivo complementario 1). En control w 1118 y tra machos mutantes, el peso adulto no fue significativamente mayor en las moscas criadas en 2Y en comparación con las moscas del mismo genotipo criadas en 1Y (Figura 4D genotipo: interacción de la dieta p = 0,4507, archivo suplementario 1). Dado que observamos una diferencia de sexo en la plasticidad del tamaño corporal dependiente de los nutrientes en el w 1118 genotipo (sexo: interacción dieta p & lt0.0001 archivo suplementario 1), pero no en el tra cepas mutantes (interacción sexo: dieta p = 0,6598 [tra 1 / Df (3L) st-j7] p=0.5068 [tra KO ] Archivo complementario 1), los hallazgos que replicamos con el volumen de pupa (Figura 4 — figura suplementaria 1D, E), nuestros datos revelan un requisito previamente no reconocido para tra en la regulación de la diferencia de sexo en la plasticidad fenotípica dependiente de nutrientes. Para determinar si tra afecta la plasticidad fenotípica a través de la regulación de solnosotros sobreexpresábamos sol en el cuerpo graso de tra hembras mutantes. Descubrimos que la reducción del tamaño corporal de tra hembras mutantes en 2Y fueron rescatadas por grasa corporal sol sobreexpresión (Figura 4 — figura suplementaria 2A). Esto es compatible con un modelo en el que el tamaño corporal más pequeño de tra hembras mutantes criadas en 2Y se debió, al menos en parte, a menores sol Niveles de ARNm.

Para determinar si la falta de una proteína Tra funcional en los machos explica su plasticidad reducida del tamaño corporal dependiente de los nutrientes, sobreexpresamos UAS-tra F en todos los tejidos usando sin hija (da)-GAL4. Primero preguntamos si la sobreexpresión de Tra afectaba la regulación dependiente de nutrientes de sol Actividad de ARNm e IIS. En control da & gt + y + & gtUAS-tra F En los machos, no hubo una disminución significativa en la expresión del gen diana de Foxo en las larvas criadas en 2Y en comparación con las larvas criadas en 1Y (Figura 4E). En da & gtUAS-tra F En los machos, sin embargo, hubo una disminución significativa dependiente de nutrientes en los niveles de ARNm de los genes diana de Foxo (Figura 4E). Debido a que observamos una interacción significativa dieta: genotipo (p & lt0.0001 archivo suplementario 1), la magnitud del aumento dependiente de nutrientes en la actividad de IIS en el da & gtUAS-tra F el genotipo fue más grande que en los machos de control. Del mismo modo, mientras sol Niveles de ARNm bajo control da & gt + y + & gtUAS-tra F los machos no fueron significativamente diferentes en las larvas criadas en 2Y en comparación con las larvas criadas en 1Y (Figura 4F), hubo un aumento dependiente de nutrientes en sol Niveles de ARNm en da & gtUAS-tra F machos (Figura 4F). En da & gt +, + & gtUAS-tra F , y da & gtUAS-tra F hembras, observamos una disminución significativa en la expresión del gen diana de Foxo, y un aumento significativo en sol Niveles de ARNm (Figura 4 — figura suplementaria 3A, B). Por lo tanto, la presencia de una proteína Tra funcional en los machos confiere la capacidad de regular al alza sol Los niveles de ARNm y la actividad de IIS, revelando que la falta de Tra en los machos normales explica la falta de un aumento dependiente de nutrientes en sol Actividad de ARNm e IIS.

A continuación, probamos si la presencia de una proteína Tra funcional en los machos aumentaría la plasticidad del tamaño corporal dependiente de los nutrientes. Observamos un aumento significativo en el peso adulto entre da & gtUAS-tra F machos criados en 2Y en comparación con machos de genotipo emparejados criados en 1Y (Figura 4G genotipo: interacción dieta p = 0,0038 Archivo suplementario 1). Este aumento dependiente de nutrientes no estuvo presente en ninguno de los controles. da & gt + o + & gtUAS-tra F machos (Figura 4G), un hallazgo que reproducimos usando el volumen de la pupa (Figura 4 — figura suplementaria 3C). Debido a que un estudio sugirió que los altos niveles de expresión de Tra pueden causar letalidad (Siera y Cline, 2008), repetimos el experimento utilizando machos de una cepa de moscas recientemente publicada en la que las moscas portan un ADNc que codifica la proteína Tra específica de la hembra golpeada en el tra locustra F K-IN ). Estos machos expresan Tra a nivel fisiológico (Hudry et al., 2019). Al igual que con da & gtUAS-tra F machos, encontramos tra F K-IN los machos tenían una mayor plasticidad del tamaño corporal dependiente de los nutrientes en comparación con el control w 1118 machos y tra KO machos (Figura 4: figura del suplemento genotipo 3D: interacción con la dieta p & lt0.0001 Archivo suplementario 1). Por lo tanto, los machos que expresan una proteína Tra funcional tienen una mayor plasticidad fenotípica en comparación con los machos de control, revelando un nuevo papel para tra al conferir la capacidad de ajustar el tamaño corporal en respuesta a una dieta rica en proteínas. En las hembras, observamos un aumento significativo tanto en el peso adulto como en el volumen de pupa en da & gt +, + & gtUAS-tra F , y da & gtUAS-tra F moscas criadas con la dieta 2Y en comparación con las hembras del mismo genotipo cultivadas con la dieta 1Y (Figura 4 — suplemento de figura 3E, F) sin embargo, la falta de una interacción significativa entre el genotipo y la dieta indica que la plasticidad fenotípica en da & gtUAS-tra F hembras no fue diferente de los controles (p = 0,5912 archivo suplementario 1), los resultados que reproducimos con el tra F K-IN alelo (Figura 4: figura del suplemento de genotipo 3G: interacción con la dieta p & lt0.0001 Archivo suplementario 1). Es importante destacar que la diferencia de sexo en la plasticidad del tamaño corporal dependiente de los nutrientes que observamos en el w 1118 genotipo de control (sexo: interacción dieta p & lt0.0001 archivo suplementario 1) fue abolido entre tra F K-IN machos y sus hembras de genotipo emparejado (p = 0.3168 Archivo suplementario 1). Para determinar si la regulación al alza dependiente de nutrientes de sol Se requería ARNm para que Tra mejorara el tamaño del cuerpo masculino en un contexto rico en proteínas, sobreexpresamos el UAS-sol-ARNi transgén en el cuerpo graso de tra F K-IN machos. Descubrimos que el tamaño corporal dependiente de los nutrientes aumenta en tra F K-IN los machos estaban bloqueados en machos con grasa corporal sol pérdida (Figura 4H), un hallazgo que reproducimos en tra F K-IN hembras (Figura 4 — figura suplementaria 3H). Esto indica que la regulación al alza dependiente de nutrientes de sol Se requiere ARNm en larvas con una proteína Tra funcional para la plasticidad fenotípica. Juntos, estos datos demuestran un nuevo papel para Tra en la regulación de la diferencia de sexo en la plasticidad del tamaño corporal dependiente de los nutrientes e identificar el cuerpo graso sol como un factor descendente que media en los efectos de Tra sobre la plasticidad fenotípica.

Coactivador transcripcional spargel representa un vínculo entre el transformador y la regulación de sol niveles de ARNm

Mientras que el gen de la determinación del sexo tra Impacta la diferenciación sexual a través de la regulación de genes diana confirmados. doble sexo (dsx FBgn0000504) y infructuoso (fru FBgn0004652), ni dsx ni fru afectan el tamaño del cuerpo (Rideout et al., 2015). Dado el papel clave de sol Al mediar el aumento dependiente de nutrientes en el tamaño corporal aguas abajo de Tra, queríamos identificar el vínculo entre Tra y la regulación de sol Niveles de ARNm. Estudios anteriores muestran que el coactivador transcripcional spargel (srl, FBgn0037248), el Drosophila homólogo de Coactivador 1-alfa del receptor gamma activado por el proliferador de peroxisomas (PGC-1α) (Tiefenböck et al., 2010), coordenadas sol Niveles de ARNm con proteína dietética (Delanoue et al., 2016). Para probar si Srl media la diferencia de sexo en la regulación al alza dependiente de nutrientes de sol niveles de ARNm, examinamos los niveles de ARNm de sol en larvas hembras heterocigotas para un alelo hipomórfico fuerte de srl (srl 1 / +) (Tiefenböck et al., 2010). En las hembras, encontramos que la regulación ascendente dependiente de nutrientes de sol Niveles de ARNm en w 1118 las larvas de control se embotaron en srl 1 / + larvas (Figura 5A dieta: interacción genotipo p & lt0.0001 Archivo suplementario 1). Para determinar si un aumento menor dependiente de nutrientes en sol Los niveles de ARNm afectan la capacidad de srl 1 / + larvas para lograr un tamaño corporal más grande en un contexto rico en proteínas, planteamos srl 1 / + larvas en 1Y y 2Y. Mientras confirmamos que srl 1 / + Las larvas no tienen defectos de desarrollo generalizados, ya que no hubo disminución en el tamaño corporal en srl 1 / + larvas hembra o macho criadas en 1Y (Figura 5B, C), mostramos que el aumento dependiente de nutrientes en el tamaño corporal en srl 1 / + las hembras fueron eliminadas (Figura 5B). Dado que el peso adulto fue significativamente mayor en el control w 1118 hembras criadas en 2Y en comparación con hembras del mismo genotipo cultivadas en 1Y (Figura 5B), esto indica que srl 1 / + las hembras tienen una plasticidad reducida del tamaño corporal dependiente de los nutrientes (genotipo: interacción con la dieta p & lt0.0001 archivo suplementario 1). En control w 1118 y srl 1 / + machos, el peso adulto no fue significativamente mayor en las moscas criadas en 2Y en comparación con las moscas del mismo genotipo criadas en 1Y (Figura 5C, interacción genotipo: dieta p = 0,8323). Este resultado sugiere que Srl media la regulación al alza dependiente de nutrientes de sol Niveles de ARNm y aumento de la plasticidad del tamaño corporal dependiente de nutrientes en larvas hembras en un contexto rico en proteínas, donde los estudios futuros deberán determinar si Srl también afecta la diferencia de sexo en el Sol circulante. De hecho, aunque el sol también está regulado en el nivel de secreción por la señalización del objetivo de rapamicina (TOR) del cuerpo graso (Delanoue et al., 2016), no encontramos diferencias de sexo en la actividad TOR del cuerpo graso ni en 1 año ni en 2 años (Figura 5 — Suplemento de cifras 1A – D). Dado que la actividad de TOR no afecta sol niveles de ARNm (Delanoue et al., 2016), que confirmamos (Figura 5 — figura del suplemento 1E), nuestros datos indican que la diferencia de sexo en la regulación al alza dependiente de nutrientes de sol Los niveles de ARNm se deben a Srl y no a TOR. Esto se alinea con nuestro hallazgo anterior de que el tratamiento de larvas con el inhibidor de TOR, rapamicina, no provocó efectos de sesgo sexual en el crecimiento de las larvas (Rideout et al., 2015).

Gen de determinación del sexo transformador (tra) requiere coactivador transcripcional spargel (srl) para una mayor plasticidad del tamaño corporal dependiente de los nutrientes en las hembras.

(A) En control w 1118 hembras y hembras con pérdida heterocigota de srl (srl 1 / +), niveles de ARNm de sol RA fueron significativamente mayores en las larvas cultivadas con una dieta rica en proteínas (2Y) en comparación con las larvas criadas con una dieta con la mitad de la proteína (1Y) (p & lt0.0001 yp = 0.0301 Student's t prueba) sin embargo, hubo un genotipo significativo: interacción con la dieta que indica que la regulación al alza dependiente de proteínas de sol RA fue embotado en srl 1 / + hembras (p & lt0.0001 ANOVA bidireccional seguido de la prueba Tukey HSD). n = 7-8 repeticiones biológicas. (B) El peso de los adultos fue significativamente mayor en w 1118 hembras criadas en 2 años en comparación con hembras criadas en 1 año (p & lt0.0001 ANOVA bidireccional seguido de la prueba de Tukey HSD) sin embargo, no hubo diferencia significativa en el peso adulto entre srl 1 /+ hembras cultivadas en 2Y en comparación con hembras con genotipo emparejado criadas en 1Y (p & gt0.9999 ANOVA bidireccional seguido de la prueba de Tukey HSD). n = 5-7 grupos de 10 moscas. (C) El peso adulto no fue significativamente mayor en ninguno w 1118 control o srl 1 /+ machos mutantes en moscas criadas en 2Y en comparación con machos criados en 1Y (p = 0,9906 yp & gt0,9999, respectivamente ANOVA bidireccional seguido de la prueba de Tukey HSD). n = 4-5 grupos de 10 moscas. (D) niveles de ARNm de sol RA no fueron significativamente diferentes en da & gttra F varones con pérdida heterocigota de srl (UAS-tra F / + da-GAL4 / srl 1 ) cultivados en 1Y en comparación con machos de genotipo emparejados cultivados en 2Y (p = 0.1405 Student's t prueba). n = 8 repeticiones biológicas. (mi) En control da & gttra F varones con pérdida heterocigota de srl, los niveles de ARNm de los objetivos de Foxo (receptor de insulina (InR)brummer (bmm), y proteína de unión al factor de iniciación eucariota 4E (4E-BP)), fueron significativamente mayores en las larvas cultivadas en 2Y en comparación con las larvas criadas en 1Y (p = 0.0266 Student's t prueba). n = 8 repeticiones biológicas. (F) El peso adulto fue mayor en da & gtUAS-tra F machos criados en 2Y en comparación con da & gtUAS-tra F machos criados en 1Y (p & lt0.0001 ANOVA bidireccional seguido de la prueba Tukey HSD). Por el contrario, el aumento de peso de los adultos dependiente de nutrientes se abolió en da & gtUAS-tra F machos heterocigotos para srl 1 (p = 0,2811 ANOVA bidireccional seguido de la prueba de Tukey HSD). n = 6–8 grupos de 10 moscas. (GRAMO) El peso adulto fue mayor en da & gtUAS-tra F hembras criadas en 2 años en comparación con da & gtUAS-tra F hembras criadas en 1Y (p & lt0.0001 ANOVA bidireccional seguido de la prueba Tukey HSD). Por el contrario, el aumento del peso adulto dependiente de nutrientes estuvo ausente en da & gtUAS-tra F hembras heterocigotas para srl 1 (p = 0,2927 ANOVA bidireccional seguido de la prueba de Tukey HSD). n = 6–7 grupos de 10 moscas. Para todos los gráficos de plasticidad de tamaño corporal, los círculos rellenos indican el tamaño corporal medio y las líneas discontinuas indican un intervalo de confianza del 95%. * indica p & lt0.05, **** indica p & lt0.0001 ns indica un error no significativo, las barras indican SEM.

Para determinar si Srl interviene en la regulación dependiente de Tra de sol niveles de ARNm, medimos sol Niveles de ARNm en hombres con expresión ectópica de Tra (da & gtUAS-tra F ). Tiempo da & gtUAS-tra F Los machos muestran una regulación ascendente significativa dependiente de nutrientes de sol Niveles de ARNm en comparación con da & gt + y + & gtUAS-tra F machos de control (Figura 4F), encontramos que sol Los niveles de ARNm ya no eran más altos en da & gtUAS-tra F machos heterocigotos para el srl 1 alelo producido en 2Y en comparación con los machos de genotipo emparejados criados en 1Y (Figura 5D). De manera similar, no observamos disminución en los genes diana de Foxo entre da & gtUAS-tra F machos heterocigotos para el srl 1 alelo criado en 2Y en comparación con machos del mismo genotipo criados en 1Y (Figura 5E), lo que indica la regulación al alza dependiente de nutrientes de la actividad de IIS en da & gtUAS-tra F los machos fue abolido en el contexto de la función de srl reducida. Dado que no observamos cambios dependientes de Tra en la actividad de TOR (Figura 5 — suplemento de figura 1F, G), cuando se toman en conjunto nuestros datos indican que la función Srl es necesaria para el aumento dependiente de Tra en sol Niveles de ARNm en un contexto rico en proteínas. Srl, por lo tanto, representa un vínculo adicional entre el gen de determinación del sexo tra y la regulación de la expresión génica. Además, mostramos que la regulación dependiente de Srl de sol aguas abajo de Tra es significativo para la plasticidad fenotípica, ya que el aumento de tamaño corporal dependiente de nutrientes se bloqueó en da & gtUAS-tra F hembras y machos heterocigotos para el srl 1 alelo (Figura 5F, genotipo G: interacción dieta p = 0.0146 yp = 0.0008, respectivamente). Si bien encontramos que srl tiene objetivos distintos a sol también fueron regulados de una manera específica por sexo por los nutrientes y la función Tra (Figura 5 — suplemento de figura 2A-D), otros objetivos de Srl funcionalmente similares no reprodujeron los cambios específicos del sexo en la plasticidad del tamaño corporal dependiente de los nutrientes que observamos tras la pérdida de Cuerpo gordo sol (Figura 5 — suplemento de figura 2E – H). Aunque no podemos descartar todos los objetivos de Srl, nuestros datos indican un papel clave para sol entre los objetivos de Srl en la mediación de los efectos de Tra sobre la plasticidad del tamaño corporal dependiente de los nutrientes. Esto revela un papel previamente no reconocido de Srl en la mediación de cambios específicos del sexo en la expresión génica, e identifica a Srl como un nuevo vínculo entre Tra y cambios dependientes de nutrientes en la expresión génica.

El aumento de la plasticidad del tamaño corporal dependiente de los nutrientes en las hembras promueve la fecundidad en un contexto rico en proteínas

Estudios anteriores han demostrado que la abundancia de nutrientes durante el desarrollo maximiza el tamaño corporal para promover la fertilidad en Drosophila mujeres (Bergland et al., 2008 Green y Extavour, 2014 Grönke et al., 2010 Hodin y Riddiford, 2000 Klepsatel et al., 2020 Mendes y Mirth, 2016 Robertson, 1957a Robertson, 1957b Sarikaya et al., 2012 Tu y Tatar , 2003), y que se requieren altos niveles de actividad de IIS para el desarrollo normal de huevos, el número de ovariolas y la fecundidad (Green y Extavour, 2014 Grönke et al., 2010 Mendes y Mirth, 2016 Richard et al., 2005). De acuerdo con estos hallazgos, w 1118 las moscas hembras criadas en 2Y produjeron significativamente más huevos en comparación con las hembras del mismo genotipo cultivadas en 1Y (Figura 6A). Esto se alinea con los hallazgos de muchos estudios que muestran que el aumento de nutrientes promueve la fertilidad (Green y Extavour, 2014 Grönke et al., 2010 Mendes y Mirth, 2016 Richard et al., 2005) y sugiere que la capacidad de aumentar la actividad del IIS y el tamaño corporal en La respuesta a una dieta rica en proteínas permite a las hembras maximizar la fecundidad en condiciones en las que los nutrientes son abundantes. Para probar esto, medimos la cantidad de huevos producidos por InR E19 / + hembras y w 1118 controles elevados en 1Y o 2Y. En contraste con w 1118 hembras, el aumento dependiente de nutrientes en la producción de huevos estuvo ausente en InR E19 / + hembras (Figura 6A). De manera similar, no hubo un aumento inducido por la dieta en la producción de huevos en dilp2 hembras mutantes (Figura 6B). Estos hallazgos sugieren que el aumento dependiente de nutrientes en la actividad de IIS y el tamaño corporal son importantes para promover la fecundidad en un contexto rico en proteínas. Este resultado se alinea con los hallazgos de un estudio anterior que muestra que la fecundidad de por vida fue significativamente menor en dilp2 mutantes criados en una dieta rica en levadura (Grönke et al., 2010). Para extender nuestros hallazgos más allá dilp genes, a continuación examinamos la fecundidad en hembras con una reducción mediada por RNAi en sol. Encontramos que el aumento dependiente de nutrientes en la producción de huevos en r4 y gtUAS-sun-RNAi hembras fue eliminado, en contraste con el fuerte aumento inducido por la dieta en la fecundidad en r4 y gt + y + & gtUAS-sun-RNAi hembras de control (Figura 6C). Juntos, estos datos sugieren que dilp2 y grasa corporal derivada sol desempeñan un papel en la maximización de la actividad de IIS y el tamaño corporal para promover la producción de huevos en un contexto rico en proteínas. Los estudios futuros deberán determinar qué aspecto del desarrollo del ovario se ve afectado por estas manipulaciones genéticas (Green y Extavour, 2014 Grönke et al., 2010 Mendes y Mirth, 2016 Richard et al., 2005), si este fenotipo es específico de dilp2, y si los efectos requieren InR función en el ovario o en otros tejidos.

El aumento de la plasticidad del tamaño corporal dependiente de los nutrientes en las hembras promueve la fertilidad.

(A) En control w 1118 hembras, hubo un aumento significativo en el número de huevos puestos por las hembras criadas con una dieta rica en proteínas (2 años) en comparación con las hembras criadas con una dieta con la mitad de la proteína (1 año) (p = 0,0009 t prueba) sin embargo, no hubo diferencia significativa en el número de huevos puestos entre InR E19 / + hembras cultivadas en 2Y en comparación con hembras con genotipo emparejado criadas en 1Y (p = 0,617 Student's t prueba). n = 19-20 repeticiones biológicas. (B) En control w 1118 hembras, hubo un aumento significativo en el número de huevos puestos por las hembras criadas en 2Y en comparación con las hembras cultivadas en 1Y (p & lt0.0001 Student's t prueba) sin embargo, no hubo diferencia significativa en el número de huevos puestos entre dilp2 hembras mutantes cultivadas en 2Y en comparación con las hembras criadas en 1Y (p = 0,4105 Student's t prueba). n = 28-30 repeticiones biológicas. (C) En control r4 y gt + y + & gtUAS-sun-RNAi hembras, hubo un aumento significativo en el número de huevos puestos por las hembras criadas en 2Y en comparación con las hembras de control cultivadas en 1Y (p & lt0.0001 para ambos genotipos Student's t prueba). En r4 y gtUAS-sun-RNAi hembras, el número de huevos puestos por hembras cultivadas en 2Y fue menor que las hembras criadas en 1Y (p = 0.0243 Student's t prueba). n = 20 réplicas biológicas. (D) En control w 1118 varones, no hubo diferencia significativa en el número de crías producidas entre una dieta de 1 año y 2 años (p = 0,3662 t prueba). Tampoco hubo una diferencia significativa en el número de crías producidas entre el control w 1118 machos y machos heterocigotos para un alelo de pérdida de función de homólogo de fosfatasa y tensina (pten genotipo pten 2L100 / +) recaudado en 1Y (p = 0.4003 Student's t prueba). A diferencia de los machos de control, pten 2L100 / + los machos criados en 2Y produjeron significativamente más descendencia que los machos con el mismo genotipo criados en 1Y (p = 0.0137 Student's t prueba). n = 11 réplicas biológicas. (mi) En control r4 y gt + y + & gtUAS-sun y r4 y gtUAS-sun varones, no hubo un efecto significativo sobre el número de crías producidas entre una dieta de 1 año y 2 años (p = 0,9222, 0,0595 y 0,32 respectivamente, t prueba). Tampoco hubo una diferencia significativa en el número de crías producidas entre el control r4 & gt +, + & gtUAS-sun machos y r4 y gtUAS-sun machos criados en 1Y (p = 0.9723 yp = 0.9969 respectivamente ANOVA de una vía seguido de la prueba Tukey HSD). n = 8-10 grupos de 10 moscas. * indica p & lt0.05, ** indica p & lt0.01, *** indica p & lt0.001, **** indica p & lt0.0001 ns indica error no significativo, las barras indican SEM.

En los machos, que tienen una capacidad reducida para aumentar el tamaño corporal en respuesta a una dieta rica en proteínas, también investigamos la relación entre el contenido de nutrientes, el tamaño corporal y la fertilidad. Cuando comparamos la fertilidad en w 1118 machos criados en 1Y en comparación con machos criados en 2Y, no encontramos diferencias significativas en el número de crías producidas (Figura 6D). Por lo tanto, ni el tamaño corporal ni la fertilidad de los machos mejoraron al criar moscas en un ambiente rico en proteínas. Dado que estudios previos sugieren que un tamaño corporal más grande en los machos promueve el éxito reproductivo (Ewing, 1961 Partridge et al., 1987 Partridge y Farquhar, 1983), a continuación preguntamos si las manipulaciones genéticas que aumentan el tamaño del cuerpo masculino también aumentan la fertilidad. Una forma de aumentar el tamaño del cuerpo masculino en 1Y es la pérdida heterocigótica de homólogo de fosfatasa y tensina (pten, FBgn0026379 pten 2L100 / +) (Figura 1 — figura suplementaria 7B). Curiosamente, la fertilidad no fue significativamente mayor en pten 2L100 /+ machos comparados con w 1118 controles criados en 1Y (Figura 6D), lo que sugiere que un tamaño corporal más grande no siempre aumenta la fertilidad en los machos. De manera similar, cuando medimos la fertilidad en r4 y gtUAS-sun machos, que son más grandes que los machos de control (Figura 3 — figura suplementaria 7B), la fertilidad no fue significativamente diferente de r4 y gt + y + & gtUAS-sun machos de control (Figura 6E). Curiosamente, cuando examinamos la fertilidad en pten 2L100 /+ y r4 y gtUAS-sun machos en 2Y, la fertilidad se incrementó significativamente en pten 2L100 /+ machos en comparación con controles de genotipo emparejados cultivados en 1Y (Figura 6D), una observación que no repetimos en r4 y gtUAS-sun machos (Figura 6E). En última instancia, esta relación menos sólida y más compleja entre el tamaño corporal y la fertilidad en los machos sugiere una posible explicación de su menor plasticidad del tamaño corporal dependiente de los nutrientes en comparación con las hembras.


Justificación experimental

Es importante señalar que nuestra definición operativa de la elección de pareja femenina (por ejemplo, Maynard-Smith, 1987 Kirkpatrick & Ryan, 1991) es muy amplia y describe colectivamente una amplia gama de procesos que causan sesgos de apareamiento entre los machos, desde la atracción / resistencia indirecta / pasiva. y varias formas de explotación masculina de los sesgos sensoriales en las hembras hacia escenarios de evaluación de pareja más directos / activos (ver Wiley & Poston, 1996 para una discusión). Masculino D. melanogaster realizar un cortejo complejo (Hall, 1994). Aunque todos los componentes incluidos parecen importantes para la aceptación femenina de cualquier hombre dado, la calificación del "atractivo" masculino solo mediante el cortejo ha resultado difícil. El apareamiento no aleatorio por tamaño en los machos es extremadamente común en los insectos (ver reseñas de Thornhill & Alcock, 1983 Choe & Crespi, 1997), y D. melanogaster no es una excepción a esta regla (Partridge, 1988). Está claro que tanto la competencia macho-macho como la elección de pareja femenina contribuyen al apareamiento no aleatorio en D. melanogaster (Greenacre et al., 1993 Markow, 1988 Iliadi et al., 2001). También está claro que el tamaño del macho está bajo selección por elección de pareja (Ewing, 1961, 1964 Partridge & Farquhar, 1983 Markow, 1986, 1988 Partridge et al., 1987a, b Wilkinson, 1987 Pitnick, 1991), aunque no está claro si esto es el resultado de alguna forma de evaluación activa de la pareja femenina del tamaño del macho. per se o si es el resultado de las preferencias femeninas por los personajes masculinos que se correlacionan con el tamaño masculino (por ejemplo, mayor persistencia en el cortejo, estímulos más fuertes del cortejo) (Partridge, 1988). Independientemente de si las hembras muestran preferencia por el tamaño del macho per se o si el objetivo de su preferencia es un rasgo en los machos que se correlaciona con el tamaño general, las hembras sesgarán los apareamientos hacia machos más grandes. Las consecuencias de la aptitud para las hembras de la elección directa e indirecta de machos grandes serán, por tanto, muy similares. En este estudio, por lo tanto, usamos el tamaño masculino como un sustituto del "atractivo" masculino para las mujeres.


Métodos

Drosophila poblaciones y genética

Las moscas se criaron en un medio alimenticio que contenía agar (10 gl -1), glucosa (167 mM), sacarosa (44 mM), levadura (35 gl -1), harina de maíz (15 gl -1), germen de trigo (10 gl -1 ), harina de soja (10 gl -1), melaza (30 gl -1), ácido propiónico y Tegosept, y en este informe se hace referencia a ellos como 'alimento para moscas' 'medio alimenticio'. Las moscas se criaron en un ciclo de luz / oscuridad de 12:12 h (LD 12:12) a 25 ° C. Las vírgenes se recolectaron usando CO2 anestesia. Las hembras fueron envejecidas en grupos del mismo sexo de 20 en viales durante 5-7 días antes de la prueba. Los machos de prueba se envejecieron individualmente durante 5-7 días en viales de vidrio (40 × 8 × 0,8-1,0) para limitar la experiencia antes de la prueba, ya que la exposición a sustancias químicas derivadas de moscas puede modificar el cortejo de los machos 15. Sin embargo, los machos que solían generar todas las hembras apareadas (indicadas como "apareadas", "m Oe", "m C", "m Oe + 7-T") tenían edades en grupos del mismo sexo de 20.

Todas las hembras utilizadas en este estudio eran de la cepa de tipo salvaje Cantón-S a menos que se indique. Las hembras manipuladas por actividad neuronal se generaron cruzando wdsx-Gal4 + 61 hombres con w 1118 + UAS-dTrpA1 / TM6b 37 mujeres, ambas fueron obsequios de S.F Goodwin. Las hembras de control Gal4 se generaron cruzando wdsx-Gal4 + machos con w 1118 ++ hembras. Las hembras de control UAS se generaron cruzando w 1118 + UAS-dTrpA1 / TM6b hembras con w 1118 ++ varones.

Todos los machos de tipo salvaje eran del Cantón-S cepa de tipo salvaje. Otros machos incluyeron: machos desprovistos de receptores odorantes clásicos orco − (worco 1 54 y sus controles genéticos, orco - rescate (worco 1 , pBac <>+>) 62, un regalo de los machos de R. Benton que carecen del receptor de olor Or67d (Or67d Gal4 / Gal4 ) y controles genéticos (Or67d Gal4 / +) 24. Los machos silenciados por actividad neuronal se generaron cruzando wOr65a-Gal4 + 26 o + Sp / CyOGr32a-Gal4 machos con + UAS-TNT + 63 hembras. Los machos de control Gal4 se generaron cruzando wOr65a-Gal4 + o + Sp / CyOGr32a-Gal4 machos con w 1118 ++ ”hembras. Los machos de control UAS se generaron cruzando + UAS-TNT + 63 mujeres con w 1118 ++ varones. todas las moscas se obtuvieron del Bloomington Stock Center a menos que se indique lo contrario.

Los enocitos ablacionados (Oe -) se generaron cruzando + PromE (800) -Gal4, tina-Gal80 ts + hembras y + UAS-StingerII, UAS-hid / CyO + Los machos y los machos de control se generaron cruzando + PromE (800) -Gal4, tina-Gal80 ts + hembras con + UAS-StingerII + machos. La progenie se desarrolló a 18 ° C hasta la eclosión (día 0), momento en el que se transfirió a 22 ° C durante 24 h. El día 1, las moscas se colocaron en tratamiento térmico durante 4 días (día 1, 2, 3 y 4) a 25ºC y se utilizaron en experimentos el día 6 (modificado de la ref. 30).

Ensayo de reconexión

Todos los ensayos de apareamiento se realizaron durante un período de 24 horas y se iniciaron en Zeitgeber Time (ZT) 8 (17:00 horas) en una incubadora con un ciclo de luz / oscuridad 12:12 h (LD 12:12). Se usó luz roja para monitorear el apareamiento en la oscuridad (como se describe en la ref. 45). Las moscas se transfirieron a las cámaras de ensayo con una pipeta bucal. Se aspiraron seis hembras vírgenes seguidas de seis machos vírgenes en una placa Petri de 55 x 8 mm que contenía un cilindro de alimento sólido para moscas (22 x 5 mm). Para pares individuales de moscas, se aspiró una sola hembra a una placa de Petri de 10 × 8 mm con una capa de alimento que recubre el fondo, seguida de un solo macho. Para monitorear la ocupación del parche de comida, se tomaron fotos de la placa de ensayo a intervalos de 2 minutos durante un período de 24 h utilizando cámaras web Logitech 910C controladas por el software Security Monitor Pro (Deskshare, Inc.). Las imágenes se recopilaron y puntuaron tanto por el número como por el tiempo de los eventos de apareamiento.

Momento de la expulsión de los espermatozoides por parte de las mujeres

Para determinar el momento de la expulsión de los espermatozoides, Cantón-S los machos y las hembras se colocaron en parejas (1 macho y 1 hembra) dentro de una placa de Petri de 35 × 10 mm que contenía una rodaja de medio alimentario (denominada placa 'pequeña') o en grupos de 12 (6 machos y 6 hembras) dentro de una placa Petri de 55 × 13 mm que contiene una rodaja de comida para moscas (denominada placa "grande"). Se observaron platos y se registró el tiempo de cópula. Inmediatamente después del final del apareamiento, los machos fueron descartados y las hembras fueron transferidas a una arena de expulsión de esperma idéntica en construcción a una arena de apareamiento. Las hembras que se aparearon en grupos fueron transferidas a una pequeña arena de expulsión fresca (permaneciendo solas), oa una nueva y grande arena de expulsión con otras cinco hembras que también se aparearon en grupo. De manera similar, las hembras que se aparearon en parejas fueron transferidas a una arena pequeña y fresca (permanecieron solas), oa una arena de expulsión grande y fresca junto con las otras cinco hembras que se habían apareado en parejas. Por lo tanto, empleamos un diseño experimental factorial 2 × 2 con el número de hembras (1 o 6) y la arena (apareamiento o expulsión) como factores fijos. Esto produjo cuatro grupos: hembras que se aparearon en un grupo y fueron transferidas juntas a la arena de expulsión permaneciendo con las mismas hembras hembras que se aparearon dentro de un grupo pero fueron aisladas después del apareamiento hembras que se aparearon en parejas pero fueron colocadas juntas en un grupo de seis. hembras después del apareamiento y hembras que se aparearon de forma aislada y se transfirieron individualmente a una arena de expulsión. Las arenas de eyección se examinaron para detectar la presencia de un tapón de apareamiento, que es autofluorescente 64, utilizando un microscopio estereoscópico MZ10F equipado con filtros para luz ultravioleta (Leica Microsystems, Ltd, Alemania) cada 30 minutos hasta que todas las hembras dentro de la arena fueron expulsadas. Se utilizó el tiempo entre la cópula y la expulsión para determinar el momento de la expulsión.

Análisis químico del estado de apareamiento

Para generar hembras de diferentes estados de apareamiento, 6 vírgenes Cantón-S se colocaron hembras y 6 machos vírgenes del genotipo indicado en el texto en una arena de apareamiento entre CT0-1. La arena de apareamiento se construyó a partir de placas de Petri de 55 × 8 mm que contenían una rodaja de comida para moscas. Una hora ASM, las hembras de cada campo de apareamiento se aislaron y se colocaron individualmente en un frasco de alimento para moscas fresco. Se comprobó la presencia de un enchufe macho en las hembras utilizando un microscopio estereoscópico MZ10F equipado con filtros para luz ultravioleta 64 para asegurarse de que se habían apareado. Una de las seis hembras se anestesió inmediatamente en hielo y se utilizó para la extracción de CHC (indicada como hembra "apareada reciente"). Las cinco hembras restantes se revisaron cada 30 minutos para detectar la presencia de un enchufe de apareamiento. Una vez que se identificó una hembra que quitó el tapón de apareamiento y el esperma asociado (hembra 'expulsada'), una hembra apareada no expulsada de la misma arena de apareamiento (hembra 'emparejada emparejada'), así como una hembra virgen ('Virgen'), fueron inmediatamente anestesiado en hielo y utilizado para la extracción de feromonas.

Análisis químico de eyección de esperma

Después de que una hembra de "análisis químicos del estado de apareamiento" expulsó el tapón de apareamiento y el esperma / líquido seminal asociado, se recogió toda la eyección de las placas con unas pinzas finas y se transfirió a un microvial de vidrio y se sometió a CHC como se describe a continuación.

Manipulación neuronal para la inhibición de la eyección de esperma

Mujeres con un canal de iones de calcio dependiente de la temperatura expresado en dsx + células, así como sus controles asociados se emparejaron con Cantón-S machos en una placa Petri de 10 × 8 mm con una capa de alimento para moscas que recubre el fondo a 22 ° C. Se descartaron todas las parejas que no copularon en 3 h. Una vez finalizada la cópula, se retiraron los machos y la placa que contenía a la hembra se colocó en una incubadora a 29 ° C o se mantuvo a temperatura ambiente (22 ° C). Once horas ASM, las hembras se congelaron instantáneamente con nitrógeno líquido, se verificó la presencia de un tapón de apareamiento para determinar si se eyectaban y se sometieron a extracción de CHC.

Análisis químico del aparato reproductor femenino y la canal.

Las hembras vírgenes, apareadas y expulsadas se generaron como se describe en el "análisis químico del estado de apareamiento" (nota: todas las hembras no expulsadas en este experimento fueron "apareadas emparejadas"). Para evaluar el perfil de hidrocarburos del tracto reproductivo y el cadáver de la hembra, se colocó a una hembra en hielo bajo un microscopio estereoscópico y se le abrió el abdomen con unas pinzas finas en condiciones secas. El tracto reproductivo intacto (incluido el ovipositor, la bolsa / útero, las espermatecas, el receptáculo de los espermatozoides, los oviductos y los ovarios) se extirpó de la canal. La canal y el tracto reproductivo se colocaron en trozos separados de papel de filtro Whatman (5 x 5 mm). Estos papeles de filtro se sometieron a extracción con CHC.

Extracción y análisis de CHC

Cada elemento (mosca entera / esperma expulsado / tracto reproductivo femenino o canal / papel de filtro) se colocó individualmente en un microvial de vidrio (Supelco, Sigma-Aldrich), que contenía 50 μl de hexano enriquecido con 10 ng ml -1 de hexacosano (C26) un estándar interno. A continuación, el vial se agitó con vórtex durante 2 min y el artículo se retiró utilizando un alfiler de metal limpio. Los viales se colocaron en un congelador a -20 ° C hasta el momento del análisis. Los extractos de hidrocarburos resultantes se analizaron utilizando un cromatógrafo de gases Agilent 7,890 con un detector de ionización de llama, una columna Agilent DB-1 (diámetro: película de 0,180 mm 0,18 μm) y un inyector split-splitless ajustado a 250 ° C con 40 ml / min splitless. fluir. La válvula del inyector se abrió 1,5 min después de la inyección en modo splitless con helio como gas portador (flujo: 37,2 cm s -1). El programa de temperatura del horno comienza a 50 ° C durante 1,5 min, aumentando a 10 ° C min -1 a 150 ° C, luego aumentando a 4 ° C min -1 a 280 ° C y manteniendo durante 5 min. Se utilizó el software ChemStation (tecnologías Agilent) para cuantificar los compuestos en función de las áreas de los picos en relación con el estándar interno C26.

Estado de apareamiento y atractivo

Se generaron hembras de diferentes estados de apareamiento como se describe en "Análisis químico del estado de apareamiento". Si el experimento implicó la decapitación (para minimizar el movimiento y el comportamiento de rechazo 41), las hembras se colocaron en hielo y se decapitaron con una cuchilla de afeitar ∼ 2 h ASM. Las hembras se transfirieron a una placa de Petri vacía y se monitorizó la expulsión de esperma. Todas las hembras se colocaron en una arena de cortejo (placas de Petri de 10 × 8 mm en capas con 1 ml de alimento para moscas) y se les dio 2 minutos para aclimatarse. Todos los platos se grabaron en vídeo con una videocámara de alta definición de Canon (Canon Legria HF M36). Para platos que contienen una hembra intacta, una virgen ingenua Cantón-S Luego se introdujo el macho probador y la placa se observó primero durante 10 minutos para determinar la cantidad de comportamiento de cortejo masculino provocado por la hembra, y luego se observó durante 20 minutos adicionales para determinar si se produjo la cópula. Si no se observó ningún noviazgo durante ese período de tiempo, no se utilizaron los datos. El índice de cortejo para las hembras apareadas y expulsadas se calculó dividiendo el número de segundos que el macho cortejó sobre el tiempo total de observación (600 s). Sin embargo, como todas las vírgenes se aparearon dentro de este período de 10 minutos, el índice de cortejo para las vírgenes se calculó dividiendo el número de segundos que el macho cortejó por la latencia de la cópula (tiempo desde el inicio del ensayo hasta el inicio de la cópula). Para los platos que contenían una hembra decapitada, se introdujo un macho probador virgen ingenuo y el plato se grabó en video para 30- (Cantón-S probador macho) o período de 45 min (todos los demás genotipos). Se determinó el índice de cortejo y la ventana de evaluación de 10 minutos comenzó con la primera aparición del cortejo masculino. Para determinar la preferencia de cortejo de Cantón-S machos de prueba para hembras apareadas versus expulsadas, dos hembras (hembra decapitada y expulsada) se transfirieron a una arena de cortejo más grande (90 de diámetro x 8 mm de profundidad) con una tapa de plástico que permite la saturación del aire con feromonas llamada 'arena cerrada' o una red de nailon en lugar de la tapa de plástico para evitar la saturación del aire con feromonas llamadas "arena abierta" y los platos se colocaron en una campana extractora. El índice de preferencia se determinó dividiendo el tiempo que un macho pasó cortejando a una hembra del estado de apareamiento indicado sobre el tiempo total que el macho pasó cortejándose dentro de una ventana de evaluación de 10 minutos (no. De segundos que el macho pasó cortejando a una hembra específica / no. De segundos que el macho pasó cortejando ). Nuevamente, la ventana de observación de los 600 s comenzó una vez que el macho mostró el primer signo de cortejo. En todos los ensayos de comportamiento, se consideró que los machos de prueba estaban cortejando si mostraban orientación, golpeteo, extensión / vibración del ala o intento de copulación (nota: la orientación solo se usó como una indicación de cortejo si seguían la extensión / vibración del ala y el intento de copulación). Se consideró que un macho exhibía cortejo si cortejaba durante al menos 30 s dentro del período de observación de 600 s. La proporción de machos que mostraron comportamiento de cortejo se determinó dividiendo la cantidad de machos que cortejaron por el número total de machos evaluados. Si una hembra "apareada" era expulsada durante este tiempo de observación, se excluía el plato. Para Cantón-S machos, las placas se descartaron y los datos no se utilizaron en el análisis si el macho no se presentó en los primeros 20 minutos y solo incluimos datos de los ensayos de elección en los que el macho cortejó a ambas hembras dentro del período de observación de 10 minutos. Observamos que los machos con deficiencias sensoriales mostraron un comportamiento de cortejo disminuido y retrasado. Para adaptarse a esto, no solo aumentamos el tiempo de observación (de 30 a 45 minutos, ver arriba) sino que también modificamos nuestro cálculo del índice de cortejo. Si el cortejo se retrasó de modo que no fuera posible un período de observación completo de 10 minutos, el índice de cortejo se calculó con un denominador modificado que reflejaba la cantidad total de tiempo posible para la observación, pero solo si este período de observación era superior a 200 s.

Bioensayo de feromonas

Los machos y hembras vírgenes fueron perfumados como se describe en Billeter et al. 30 con la modificación de que los machos vírgenes fueron anestesiados con CO2. Las moscas se perfumaron en grupos unisex de 7 donde se usó 1 de esas moscas para confirmar la cantidad de feromonas transferidas y las otras 6 se usaron para ensayos de cortejo. Las hembras vírgenes de tipo salvaje se perfumaron con cVA, 7-T o ambos en cantidades variables. Las hembras se decapitaron 1 h después del protocolo de perfumado, y la hembra se colocó individualmente o junto a una hembra virgen de referencia en placas de Petri de 10 × 8 mm en capas con 1 ml de alimento para moscas. Un solo tipo salvaje Cantón-S El macho probador se transfirió al plato y se filmó el comportamiento de cortejo, y se calculó un índice de cortejo o un índice de preferencia para las hembras perfumadas en un ensayo sin elección o elección, respectivamente. Oe - los machos fueron perfumados con 7-T. Después de perfumar, a los machos se les dio 1 hora para recuperarse y luego se colocaron con las hembras en el paradigma de apareamiento grupal. Las hembras apareadas con Oe - machos perfumados con 7-T se utilizaron luego individualmente en placas Petri de 10 × 8 mm en capas con 1 ml de alimento para moscas. Un solo tipo salvaje Cantón-S El macho probador se transfirió al plato y se filmó el comportamiento de cortejo y se evaluó el índice de cortejo o se utilizó a la hembra en el análisis químico para determinar el perfil químico.

Análisis estadístico

Para estimar la varianza en el tiempo para volver a aparearse (Fig. 2e), se realizó un análisis bootstrap utilizando el software Matlab (MathWorks). Los primeros seis tiempos de apareamiento utilizados para medir el tiempo hasta el primer apareamiento de una réplica determinada en los experimentos de grupo se reorganizaron aleatoriamente con los de las otras réplicas. Esto generó pseudo-réplicas formadas por los tiempos de apareamiento observados, pero en clasificaciones aleatorias. Este proceso se repitió 10.000 veces y representa todas las combinaciones posibles de rangos de tiempo para volver a aparearse. La varianza en los tiempos de apareamiento de estas pseudo-réplicas se comparó con la varianza observada en pares utilizando el software SPSS (IBM, Inc.) para estimar el grado de variabilidad entre muestras en los dos contextos sociales.

Para el análisis del momento de la expulsión de espermatozoides en un grupo frente a un par (Fig. 2f), la unidad de replicación fue la arena de apareamiento. Los efectos del contexto social durante y después del apareamiento sobre el momento de la expulsión de los espermatozoides se determinaron utilizando un modelo estándar de efectos mixtos de mínimos cuadrados en el que las variables eran continuas y se distribuían normalmente. Las condiciones previas y posteriores al apareamiento, así como sus interacciones, se modelaron como efectos fijos y las arenas de apareamiento como efectos aleatorios. El modelo se ejecutó con JMP v. 9.0 para Mac.

El análisis estadístico de los datos del perfil químico se realizó utilizando GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc., EE. UU.). Analizar las diferencias en la cantidad de sustancias químicas entre los grupos (vírgenes, apareados recientes, apareados apareados y eyectados o hembras que expresan dTrapA1 en dsx + células y sus controles asociados), primero verificamos la distribución de los datos con una prueba de Kolmogorov-Smirnov (con Dallal-Wilkinson-Lillie para pag valor) por normalidad. Si los datos no estaban distribuidos normalmente, realizamos una transformación logarítmica y luego confirmamos una distribución normal con la misma prueba. Si los datos aún no estaban distribuidos normalmente, realizamos un análisis estadístico de los datos transformados y observamos qué grupos no eran normales. Las diferencias entre las hembras vírgenes, apareadas recientes, apareadas emparejadas y expulsadas se evaluaron con un análisis de varianza unidireccional (ANOVA) seguido de una prueba post-hoc de Tukey. Las diferencias entre vírgenes, hembras apareadas con Oe, o machos de control, y hembras apareadas con Oe, o machos de control y expulsadas, se evaluaron con un ANOVA de una vía seguida de una prueba de Tukey. post hoc prueba. Para investigar la ubicación de las sustancias químicas derivadas de los machos en las hembras apareadas y expulsadas, se utilizó un ANOVA bidireccional para comparar las hembras apareadas con Oe, o controlar los machos y las hembras apareadas con Oe, o controlar los machos y expulsarlos, así como la cantidad. de productos químicos en la canal o dentro del tracto reproductivo.

El análisis estadístico del cortejo masculino provocado por hembras con diferentes estados de apareamiento se realizó utilizando GraphPad Prism 5 o R 3.2.0 (The R Foundation for Statistical Computing). La distribución de los datos se verificó con una prueba de Kolmogorov-Smirnov (con Dallal-Wilkinson-Lillie para pag valor) por normalidad. Si los datos no estaban distribuidos normalmente, realizamos una transformación de raíz cuadrada seguida, si es necesario, una transformación de arcoseno, luego confirmamos una distribución normal con la misma prueba. Para los datos del índice de cortejo calculados en el ensayo de cortejo sin elección, se realizaron comparaciones por pares con un t-prueba (datos distribuidos normalmente) o una prueba de Mann-Whitney Las comparaciones entre los grupos se realizaron con un ANOVA de una vía (datos distribuidos normalmente) o una prueba de Kruskal-Wallis seguida de una prueba de comparación múltiple de Tukey, una prueba de comparación múltiple de Bonferoni o una prueba de comparación múltiple de Dunn. Los datos del índice de preferencia dentro de un ensayo de elección no siguieron una distribución gaussiana, por lo que se utilizó la prueba exacta de dos colas de Wilcoxon de rango con signo para probar si los hombres que cortejaban preferían una mujer sobre la otra. Los datos de preferencia se probaron contra la hipótesis nula de que los hombres no tomaron una decisión, sin que la preferencia se estableciera en "0". Para comparar grupos dentro de cada experimento de preferencia, se aplicó una regresión logística cuasibinomial sobre las proporciones de cortejo hacia la hembra virgen. Los datos se organizaron como una matriz de dos vectores: número de éxito (parte del tiempo que corteja a la hembra virgen) y número de fracasos (parte del tiempo que corteja a la otra hembra). Para determinar las diferencias en la propensión a aparearse, se comparó el número de machos que mostraban un comportamiento de cortejo con el número de machos que no mostraron al menos 30 s de comportamiento de cortejo mediante una prueba de chi-cuadrado (pag& lt0.05). Para determinar las diferencias en la latencia de cortejo a hembras con diferentes estados de apareamiento (Virgen, Pareja reciente, Pareja emparejada y Expulsada), primero verificamos la distribución de los datos con una prueba de Kolmogorov-Smirnov (con Dallal-Wilkinson-Lillie para pag valor) para la normalidad y los datos analizados con una prueba de Kruskal-Wallis.

Disponibilidad de datos

Todos los datos relevantes están disponibles de los autores a pedido.


GRAMO

Incluso si se pudieran identificar los genes que son necesarios solo para eventos particulares del desarrollo, aún sería necesario saber cómo interactúan con los genes que se necesitan durante todo el desarrollo. ¿Hasta qué punto está restringida en el desarrollo la actividad de los genes? ¿Cuándo se necesitan los productos genéticos? ¿Existen transiciones temporales importantes en la actividad genética? ¿Hay cambios significativos en la acumulación, procesamiento, ensamblaje o uso final de productos genéticos? Las técnicas moleculares pueden proporcionar información detallada sobre cuándo los genes están activos (cf. SAVOINI

et Alabama. 1981 DAVIDSON, HOUGH-EVANS y BRITTEN 1982), mientras que los métodos genéticos

Los ods pueden investigar cómo se utilizan los productos genéticos. Sin embargo, para evitar la preselección de genes con roles de desarrollo particulares, los mutantes deben elegirse sobre la base de

634 L. GRAMO. ROBBINS

de la tractabilidad genética en lugar de la especificidad del desarrollo. Con este fin, se ha diseñado un sistema genético para el examen de los componentes maternos y cigóticos de la actividad de los genes letales cigóticos.

La metodología utilizada aquí se informó anteriormente (ROBBINS 1980). En esencia, la reducción de la actividad del gen materno combinada con la reducción de la actividad del gen cigótico expone la función materna y cigótica superpuesta. Se utilizó el examen de las deficiencias de la región zeste-white para definieron los parámetros experimentales necesarios, e indicó que varios genes de la región tienen interacciones materno-cigóticas más o menos severas.

El comportamiento materno y cigótico de mutaciones de cistrón único en los genes esenciales de la región zeste-white del cromosoma X de Drosophila melangogaster se informa aquí. Se utilizó heterocigosidad mutante para reducir la actividad de los genes maternos, y se utilizó la variación del efecto de posición para alterar la actividad de los genes cigóticos. El primero producirá un déficit parcial de ovocitos si el gen es activo desde el punto de vista materno. Ese déficit suele ser indetectable, pero en los embriones cuya propia actividad génica está suficientemente reducida, el defecto combinado puede ser fatal si, y sólo si, se requieren productos empaquetados con la madre y codificados con cigoto al mismo tiempo. La gravedad de la variación del efecto de posición y, por tanto, de la actividad del gen cigótico, se manipuló mediante el uso de diferencias de temperatura y mediante la inclusión o exclusión de un Y cromosoma.

Aunque las deficiencias utilizadas para el desarrollo de esta técnica son necesariamente amorfas para los loci suprimidos, no es necesario que las mutaciones de cistrón único lo sean. La actividad residual de los productos génicos mutantes podría ocultar los componentes maternos o cigóticos en estos experimentos. Sin embargo, al menos 10 de los 13 los loci examinados tienen interacciones letales cigóticas maternas demostrables. Si la región de zesteblanco no es excepcional, el uso secuencial de productos génicos sintetizados constitutivamente puede ser de considerable importancia en el desarrollo.

MATERIALES Y MÉTODOS

Para examinar a los mutantes sistemáticamente en cada una de las funciones esenciales de la región zeste-white, se comparó la viabilidad de los hijos de duplicación mutante (Dp) en cruces recíprocos: uno en el que las madres eran heterocigotas para el mutante y otro en el que las madres tenían dos hijos salvajes. -Copias de tipo de la región y el cromosoma mutante fue transmitido por el padre. Un componente materno podría quedar oscurecido por una actividad demasiado baja de la Dp (en cuyo caso los machos mutantes Dp morirían en ambos cruces) o una actividad demasiado alta de la Dp (en cuyo caso los machos mutantes Dp sobrevivirían en ambos cruces). Usando los resultados del estudio de deficiencia como Como guía, se eligieron cuatro condiciones para el presente estudio: uso de Dp (l4) mg en machos X / O en 19' y 25 & # 34 y uso de D p (1 4)

# en varones X / Y a los 25 y # 34 y 29". Dp (14) mg contiene toda la región blanca zeste y se utilizó para las pruebas de todos los mutantes. La variación del efecto de posición es más severa en Dp (14) flBg pero contiene solo el zw5, zw7, zw9,z w l l y zw12loci. Se usó solo para pruebas de mutaciones en esos genes.

mutante o control adjunto-XY Dp (l4) mg X

y su recíproco de transmisión paterna:

mutante o control adjunto-X Dp (l4) mg X

2, W + Y 0 spaPo '

mutante o control adjunto-XY Dp (l4) wm & # 34 & # 34 & # 34

y su recíproco de transmisión paterna:

mutante o control adjunto-X D p (1 4)

En los cruces de transmisión materna (1 y 3), el número de hijos mutantes Dp y no mutantes puede compararse, mientras que en los cruces de transmisión paterna (2y 4) se puede comparar el número de hijos de Dp mutantes e hijas de X / w + Y unidas. Los mutantes en genes que son activos tanto materna como zigótica, y para los cuales se utilizan productos empaquetados maternos y codificados zigóticamente durante el desarrollo cigótico, producirán una menor recuperación de machos Dp mutantes en los cruces de transmisión materna.

Donde los cromosomas mutantes estaban marcados por y, un cromosoma de tipo salvaje, en lugar del y pn cromosoma, se utilizó en los cruces de transmisión materna. Los cruces adicionales que se realizaron en algunos casos se describen en el RESULTADOS sección. Un El cromosoma Oregon-R X se utilizó como control.

En cada caso, las moscas sometidas a prueba se criaron a la temperatura de prueba. Todos los cruces fueron de hembras o machos de prueba única con tres probadores XY adjuntos o X adjuntos. Fueron hechos en medio de levadura de cerveza de harina de maíz, melaza, en frascos de concha. Todas las mutaciones de zeste-white se mantuvieron en reservas mutantes / w + Y X C (l) DX / w'Y. Se pueden encontrar más descripciones de las mutaciones y cromosomas utilizados en LINDSLEY y GRELL 1968 JUDD, SHEN y KAUFMAN 1972 SHANNON et al. 1972 LIM y SNYDER 1974 y ROBBINS 1977).

A En los siguientes párrafos se presenta un análisis detallado de los datos. Aquellos lectores que no estén interesados ​​en el análisis per se pueden pasar cómodamente a la siguiente sección.

Los resultados de los cuatro conjuntos de cruces recíprocos se dan en las Tablas 1 mediante

3. Las interacciones letales materno-cigóticas están señaladas por la recuperación deprimida de machos Dp mutantes en los cruces de transmisión materna. Además, ese efecto debería depender del nivel de variedad. Un ejemplo, zwYe3, se seguirá a través de las tres tablas. En la Tabla 1, e3Dp (14) mg hijos de madres heterocigotas mutantes tienen pero 9% la supervivencia de sus hermanos no mutantes, pero los hijos e3Dp de madres normales sobreviven tan bien como sus hermanas X adjuntas en cruces realizados en

19'. La interacción letal es mucho menos grave en 25' (recuperación de la transmisión materna = 0.86, recuperación de la transmisión paterna = 1.13, Mesa 2 ) ,algo mayor cuando la duplicación menos activa (D

) y un cromosoma Y se utilizan en 25' (recuperación de la transmisión materna = 0.55, recuperación de la transmisión paterna = 1.40, Mesa 3-25'), y de nuevo moderado un poco en 29' (recuperación de la transmisión materna = 0.68, recuperación de la transmisión paterna = 1.45, Mesa 3-

Sin embargo, las mutaciones se aislaron hace algún tiempo. (JUDD, SHEN y KAUFMAN 1972, LIM y SNYDER 1974) en entornos heterogéneos y las poblaciones podrían portar mutaciones de segundo sitio que podrían confundir estos experimentos. Mantenimiento de los cromosomas mutantes con w + Yexcluye la presencia de mutaciones letales en la mayor parte del cromosoma X, pero hay varias otras posibles fuentes de variación extraña:

636 L. C.ROBBINS

Recíproco cruces utilizandoDp (14) mg Utah19'

d28, y + i24, y + k16,y +

827, Y + j1, Y +

31 veces, y + 820, y + zw5

g28, y + 44j, y + 6b, y +

g m y 2 k18, y +

hola y + i20, y + A223, y 2

741 961 670 330 524 465 532 427 834 336 373 532 438 248 674 862 350 481 1051 420 600 451 358 383 583 438 545 629 454 388 957 789 319 1028 711 922 513 391 520 487 557 466 708 331 386 575 472 206 630 898 389 519 1020 368 498 392 368 433 589 1040 387 342 679 455 418 971 849 342

710 459 1302 680 468 196 121 413 288 347 216 456 329 365 230

1197 260 191 316 258 514 402 347 171 208 151

982 668 534 435 267 542 394

865 426 265 504 375 421 395 339 226 416 221 534 335 541 415 442 241 484 322 372 233 214 140 397 267 749 548 860 555 233 98

1080 * 538264 4 46 9 18 18263 12 15425155 92914497401229 16 41 94 38 66 51 61 14322124 29122213797770 7 Recuperación

1.6 0.92 1.4 0.83 1.9 0.46 0.9 0.02 1.3 0.11 1.2 0.03 1.4 0.05 1.3 0.06 1.6 0.44 1.4 0.05 1.5 0.05 1.7 0.93 1.1 0.60 1.6 0.51 1.4 1.86 1.4 0.83 1.9 1.14 1.9 0.49 0.8 0.09 1.8 0.12 1.6 0.21 1.7 0.09 1.6 0.23 1.6 0.16 1.5 0.14 0.9 0.03 1.7 0.91 1.8 0.31 1.2 0.10 0.8 0.69 1.7 0.64 1.4 1.23 1.7 1.09 1.0 0.04

Transmisión paterna Daugh-Sons Recovery

696 823 1206 521 1077 630 970 25 780 352 717 362 566 463 729 423 524 225 784 349 499 265 521 293 169 73 635 369 610 549 1326 645 233 217 315 166 721 2 405 213 627 188 565 332 346 166 227 149 658 312 1414 1

500 514 317 183 651 139 407 0 707 315 1195 825 1583 895 484 68

Transmisión materna Transmisión paterna

Hijas Hijos Recuperación Hijas Hijos Recuperación

Mutante m + m / + m +: Dp + m + Dp m +

g3, Y + k9, Y +

572 344 671

586 433 701

445 306 316

348 238 308

308 194 211

1.4 0.77 1.4 0.71 0.9 0.68

258 406 638

168 222 284

1.30 1.09 0.89

239 356 393

1.5 2.00 1.5 0.38

1.3 0.18 1.3 0.01

metro = mutante, rec = recombinante (ver texto). * Incluye machos Dp y Dp + Oregon-R. Dónde el cromosoma mutante está marcado por y, m'Dp + y m + Los machos Dp son indistinguibles.

Las recuperaciones en los cruces mutantes se calcularon como: Transmisión materna: machos no mutantes

= 2 X (metro' machos) / hembras mutantes Dp machos = 2 X (machos mDp) / (machos m +). Transmisión paterna: machos mutantDp = 2 X (mDp machos) / (hembras).

Las recuperaciones de control se calcularon de manera similar, excepto que el número de machos Oregon-R no fue duplicado. En ausencia de otras mutaciones ligadas al cromosoma X, la recuperación calculada de los machos no mutantes se espera que sea mayor que 1 debido a la producción desigual de XY adjunto y 0 esperma.

1) Variación de fondo autosómica: controlada porque afectaría la recuperación en ambos cruces recíprocos.

2) mutaciones letales o semi-letales cubiertas por w + Y que están estrechamente vinculados a, pero fuera de, la región zeste-white.

Estos mutantes no estarían cubiertos por Dp (l4) mg y / o D P (

y produciría recuperaciones deprimidas en ambas partes de uno o ambos pares de cruces recíprocos. Dividir la recuperación en el cruce de transmisión materna por el recíproco elimina el efecto de tales mutantes. Uno de esos ejemplos fue encontrado:

3) Mutaciones en la base del X cromosoma, incluidas las mutaciones bb, que están cubiertas por w + Y.

Estos mutantes afectarían la recuperación en el cruce de transmisión paterna, pero, debido a que las mutaciones basales no están vinculadas a la región zeste-white, no tendrían ningún efecto sobre la recuperación calculada en los cruces de transmisión materna. bb mutaciones tendrían este efecto en los cruces Dp (l4) mg, donde X / O machos

se recuperan, pero no tendrían ningún efecto en los cruces donde X / Y

se producen machos. Las mutaciones no bb deprimirían la recuperación aparente en los cruces de transmisión paterna en ambos casos.

Se encontraron dos ejemplos de bb claros: zwgk18 y zwl @ 223. El primero se comporta como se describió anteriormente, el segundo, aunque no se puede probar con Dp (14) flG8, dio numerosos hijos fenotípicamente bb. Es probable que otros dos cromosomas también presentaran mutaciones bb: Z W y

dos Z W y uno

los machos recuperados se veían bb. Dos cromosomas

638 L. GRAMO. ROBBINS

Cruces recíprocas utilizando Dp (l4) mg a t 25 '

Transmisión materna Transmisión paterna

Recovery Daugh- Sons Recovery

Mutante m + m / + m f, D p + mt.Dp m.DP m + m.DP

g31, y + d13, y + d13, rec

zw2 c21, y + 123, y + b l l, y + h22, Y

k22, y + b12, y + d28, y f i24, y + k16, y + g24, Y

31 veces, yt g20, Y + j25, Y + g28, y +

6b, Y + g10, Y2 zw3 zw4 zw5 zw6 zw7 zw8 zw9 k18, y + k18, rec hola, y +

i20, y + A223, y 2 Z W l O

791 832 549 563 387 433 524 521 426 461 1300 1310 948 1031 1612 1869 637 532 1010 931 751 718 706 665 299 348 196 227 508 465 708 697 593 569 604 628 869 841 479 524 639 536 448 432 478 491 591 596 457 519 896 919 553 561 566 471 760 896 607 572 432 428 673 773 698 714 486 521

599 446 737 300 211 252 194 413 274 1047 752 856 596 1216 966

846 759 473 487 398 497 423 331 234 192 127

714 543 403 515 440 616 481

649 500 527 297 358 528 499 428 470 415 457 222 340 524 591 233 347 471 245 312 399 302 297 331 322 283 208 266 403 448 172

1062* 333 252 112 186 71 57 119 155 174 158 437 276 159 740 457 420 463 16 135 154 232 327 363 86 73 281 242 170 258 292 643 877 92

1.3 1.01 1.3 0.90 1.3 0.99 0.9 0.50 1.6 0.43 1.4 0.08 1.5 0.08 1.3 0.11 1.5 0.37 1.3 0.28 1.2 0.36 1.3 0.95 1.7 0.98 1.5 1.00 1.5 2.07 1.4 0.97 1.6 0.88 1.8 0.84 0.8 0.05 1.7 0.32 1.7 0.31 1.2 0.86 1.4 0.98 1.6 0.78 1.6 0.21 0.8 0.20 1.4 0.70 1.4 0.66 0.9 0.46 0.7 1.20 1.4 0.96 1.3 1.39 1.5 1.69 0.8 0.45

Transmisión materna Transmisión paterna

b18, y + 609 637 475 387 432 1.4 1.00 274 151 1.10

05, y + 570 563 377 402 439 1.4 1.13 388 185 0.95

83, Y + 531590 308 263271 1,0 0,95 722 264 0,73 k9, Y + 355 354 389 209 653 1.7 2.18 982 897 1.83

k l, y + 523 547 460 328 244 1.5 0.62 1033 502 0.97

e50, y 2 464 487 461 295 187 1.6 0.49 760 420 1.11

13, v 2 631 585 501 337 42 1.4 0.10 492 248 1.01

m = mutante, rec = recombinante (ver texto). * Incluye ambos Dp y Dp + Machos Oregon-R. Las recuperaciones se calculan como se indica en la Tabla 1.

La cruz de transmisión tenía un ojo reducido en lugar de cama y desayuno fenotipo, y el cromosoma zwllg3 tenía un semiletal sensible a la temperatura, no cubierto de Y, separable.

Los cruces incluyen una prueba incorporada que confirma la presencia de tales mutantes extraños. Aunque la recuperación de los machos con Dp mutante (en comparación con los machos normales) no se vería afectada en los cruces de transmisión materna, la recuperación de todos los machos estaría deprimida. Esta depresión se puede medir por la proporción de hombres no mutantes a mujeres. En el caso extremo, en casos letales completos en la base del cromosoma, la recuperación de los machos normales sería la mitad de la que se observa en los cromosomas que no portan tales mutaciones extrañas. La comparación de las proporciones de machos y hembras normales confirma, en cada caso, la presencia de una segunda mutación en la base del X cromosoma.

Una vez identificadas por estos criterios, estas mutaciones se pueden comparar con las demás utilizando únicamente los datos de transmisión materna.Sin embargo, estas inferencias se comprobaron para dos cromosomas reemplazando la base de la X cromosoma por recombinación. zwld13, y + spl sn3 / w + Y y zw9k1s, y + spl sn3 / Los machos w + Y se cruzaron con año / año hembras. Se cruzaron hijos e hijas F1 y se seleccionaron recombinantes spl sn + / wCY. Los cromosomas recombinantes se comportaron como se esperaba y confirman las conclusiones que razonablemente se habrían extraído de los cruces originales.

4) Mutaciones subvitales en otras partes del X cromosoma.

Los efectos de tales mutaciones no se controlan ni se detectan fácilmente a menos que la reducción de la viabilidad sea sustancial y la recombinación entre la mutación del segundo sitio y la región zeste-white sea frecuente. Sin embargo, su presencia no reconocida afectaría la recuperación en los cruces de transmisión paterna más que en los cruces de transmisión materna. Por lo tanto, las interacciones materno-cigóticas se oscurecerían en lugar de identificarse cuando no exista ninguna. El cromosoma zwlb22 probablemente tiene una mutación de segundo sitio bastante extrema de este tipo, ya que la supervivencia de los machos con Dp mutante está algo deprimida en los cruces de transmisión paterna.

640 L. GRAMO. ROBBINS TABLA 3

Cruces recíprocas utilizando D p (1 4)

Transmisión materna Transmisión paterna Recuperación Hijas Hijos Recuperación

Mutante m + m / + m + mDp

827, y + 667 j1, Y + 744 e3,y 2 747 g20, y + 755 zw7

k18, y + 767 k18, rec 495

83. Y + 599 zw12

k l, Y + 614 705 651 738 767 746 812 811 482815627 a49 637 622 766 754 991762750 572841934561767729820

496 1.1 1.32 34 1.3 0.07 211 1.0 0.55 264 1.2 0.64 229 1.2 0.48 458 0.9 1.22 315 1.2 1.10 463 1.1 1.10 110 0.9 0.39 458 1.1 0.98

738 1.2 1.92 250 1.2 0.66 - 29' 872 1176 626 420 395 1072 683 458 418 607 1859 974 1096

1377 1.58 550 0.94 258 0.82 293 1.40 482 0.90 166 0.84

435 1.27 327 1.43 167 1.38 246 0.81 117 0.13 754 1.55 531 0.97

g27, y + 397 jl, y + 643 e3, y 2 603 31x, y + 473 zw7

bl8, y + 482 g3, Y + 720 a5, Y + 468

kl, y + 486 664 3916916005093814705474975156456659491795450779639552347457576551604536588619875 & # 34201171 217253147241335295334194685188

1.3 1.10 1.1 0.89 1.2 0.44 1.1 0.68 0.9 0.85 1.1 0.92

1.0 1.05 1.0 1.16 1.1 1.01 1.2 1.11 0.8 0.72 0.9 2.33 1.3 0.61

560 494 328 293 356 297 165 452 342 420 1185 205 205

1434 2.56 378 1.53 243 1.48 212 1.45 272 1.52 252 1.70 196 2.38 392 1.73 275 1.61 377 1.80 50 0.08 425 4.14 293 2.86

mutantes en las cuatro condiciones de prueba. En primer lugar, no es necesario que las mutaciones de un solo cistrón carezcan de actividad génica, y los productos génicos en sí mismos no necesitan ser absolutamente necesarios para la viabilidad. Se sabía de antemano que algunos de los mutantes zeste-white tenían fugas y / o eran sensibles a la temperatura (SHANNON et al. 1972). Los machos supervivientes mutantes no-Dp son indistinguibles de los machos mutantes Dp. Por lo tanto, para mutantes con fugas, las recuperaciones medidas son mayores que 1.0 y reflejan la viabilidad sumada de ambas clases de machos mutantes.

En segundo lugar, hiperploidía para las duplicaciones o para

W + Y,

Dejar: X = viabilidad de hijos mutantes Dp de madres heterocigotas y = viabilidad de hijos mutantes Dp de madres X adjuntas a = viabilidad de hijos Oregon-R

b = viabilidad de hijos mutantes no zeste-white, no Oregon-R en la ma-

C= viabilidad de hembras adheridas-X / w + y. cruces de transmisión ternal

Luego, las recuperaciones observadas se relacionan con las viabilidades de los componentes mediante: 1)

recuperación de machos mutantes Dp en el cruce de transmisión materna = x / b 2) recuperación de machos Dp mutantes en el cruce de transmisión paterna = y / c 3) recuperación de machos Oregon-R en el cruce de transmisión materna = a / b 4) recuperación de machos Oregon-R en cruce de transmisión paterna = a / cy el efecto materno se puede calcular como: (x / y) = (1) X (4143) x (2).

El parámetro de efecto materno desarrollado en la sección anterior tiene un valor cercano a 1 en ausencia de un efecto materno, y un valor de 0 si los machos Dp mutantes son completamente inviables en el cruce de transmisión materna, pero perfectamente viables en el cruce de transmisión paterna. Valores mayores que 1 reflejan tanto la dispersión estadística como la presencia de semiletales ligados al cromosoma X que no son de la región blanca zeste como se describió anteriormente. De nuevo usando 2

efecto ternal en machos de e3Dp (14) mg a 19' es:

0.09 (recuperación observada de e3Dp hijos de e3 / a pnmadres)

0.92 (recuperación observada de hijos Ore-R de madres Ore-R / y pn)

1.18 (recuperación observada de hijos e3Dp de madres adjuntas-X)

1.18 (recuperación observada de hijos Ore-R de madres adjuntas-X)

Los resultados se resumen en la tabla 4 donde se ha calculado el efecto materno para todos los mutantes en las cuatro condiciones experimentales. Cabe señalar varios elementos:

Interacciones letales materno-cigóticas de mutantes de la región zeste-white

Locus alelo 19' z w l

zw2 zw3 zw4 zw5 zw6 zw7 zw8 zw9

d13 d13 c21 123 b11 h22 k22 b12 d28 i24 k16 g24 e4

il a25 b23 e5 e3 31x g2O j25 44j 6b 810 k18 k18 h10 i20 A223 g28 1.23 0.50 0.02* 0.19 0.04 0.04 0.08 0.65 0.08 0.06 1.06 0.88 0.55 1.32 1.09 0.78 0.60 0.04 * 0.14 0.46 0.10 0.31 0.15 0.19 0.03 * 0.59 0.35 O.10 * 0.69 * 0.92 1.14 1.23 0.04 *

250 25" 290 1.99 1.31 0.50* 0.71 0.11 0.10 0.15 0.68 0.39 0.53 1.06 1.41 1.61 1.67 1.27 0.97 1.18 0.05* 0.43 0.54 1.06 1.32 1.06 0.36 0.20* 0.88 0,78 0,46 * 1,20 * 1,09 1,24 1,39 fl 45 *

0.55 1.09 1.06 1.40 0.73 1 1 6

Proximal w + y cubierto semi-letal reducido

Fenotipo ocular recombinante libre semi-letal

Transformaciones homeóticas en el efecto materno

Transformaciones homeóticas en fugitivos de efecto materno

Alas subvitales estrechamente vinculadas extendidas

Sensible a la temperatura semi-letal Sensible a la temperatura semi-letal bobbed

bobbed 'recombinante Semi-letal

zwll b i a 0.76 1.27 1.89 1.56

0 5 0.83 1.64 1.66 1.44

g3 0,68 * 0,95 * 0,39 * 0,72 * Proximal w + Ysemi-letal cubierto

zw12 k9 1,31 1,67 1,70 1,30 Semi-letal

zw13 e50 0,47 0,63 No disyunción sensible al frío en mutante /

13 0,01 0,14 No disyunción sensible al frío en mutante / w + Ymachos

El efecto de la heterocigosidad materna mutante sobre la supervivencia de machos mutantes Dp se calcula como

* Recuperación de machos Dp mutantes en cruces de transmisión materna. No corregido para control o para descrito en el texto.

recuperación en cruce de transmisión paterna.

dos alelos z w l l dieron resultados sugerentes, pero si hay algún efecto, ciertamente no es sorprendente, y probablemente sea más seguro descartar los resultados z w l d 2 2 3 debido a la presencia de bb.

2) Hay efectos marcadamente diferentes de diferentes alelos en muchos de los loci, incluso entre los alelos que no muestran fugas en una prueba simple de letalidad. Estas diferencias pueden observarse entre los alelos de zwl, zw3, zw4, zw7, zw8 y zw13. En un caso (zw3) la diferencia se acerca a un orden de magnitud.

3) Incluso algunos alelos semiletales y sensibles a la temperatura muestran una acción cigótica materna -

123. Es de suponer que todos los machos mutantes Dp sobreviven en estos casos, pero los que escapan mutantes no Dp son sensibles al déficit de ovocitos.

4) Aunque no se intentó monitorear de cerca los fenotipos de los sobrevivientes, se evidenció un efecto morfológico materno interesante. Para dos alelos zw3, los supervivientes dp mutantes del efecto materno muestran frecuentes transformaciones homeóticas atávicas, de deleción y duplicación de imagen especular (GARCIA-BEL-

LIDO 1977) correspondiente a muerte celular en discos imaginales. No se observaron transformaciones homeóticas en hijos con Dp mutante de madres normales, y la frecuencia de transformaciones fue mayor en 19 'donde la supervivencia fue menor. Por ejemplo, para

, Se observaron 8 moscas transformadas en 15 supervivientes en 1 9 O, mientras que a los 25 & # 34, se encontraron 10 moscas transformadas entre 158 supervivientes. Se observaron transformaciones de disco de ojo / antena, pierna y ala. Se han observado transformaciones similares en parches de tejido masculino en ginandromorfos zw3 (T. KAUFMAN, comunicación personal). Aunque periférico a este informe, esta observación sugiere que la viabilidad marginal proporcionada por el sistema MuntDp podría ser útil para exponer fenotipos de desarrollo interesantes.

644 L. GRAMO. ROBBINS DISCUSIÓN

Por lo menos 10 de El 13 Los loci letales de la región zeste-white están activos tanto desde el punto de vista materno como zigótico, y durante el desarrollo se utilizan tanto los productos génicos empaquetados por vía materna como los codificados por vía zigótica. El comportamiento de los otros tres genes es discutible. Las pruebas de una muestra limitada de alelos no son suficientes para descartar la función del gen materno. La detección de un componente materno depende de que se hayan reducido suficientemente las actividades de los genes maternos y cigóticos, y es posible que un hipomorfo no cumpla con esa condición. Es evidente a partir de la variación en la respuesta entre los alelos en aquellos genes que son demostrablemente activos tanto materna como zigótica, que la mayoría de los mutantes zeste-white son hipomorfos. De hecho, la interacción materno-cigótica permite una clasificación aproximada de la actividad residual de muchas de las mutaciones.

Aunque estos experimentos dependen de la interacción entre un defecto materno parcial y un mal funcionamiento cigótico parcial, la observación de que se producen diferencias cruzadas recíprocas con varios mutantes bastante permeables sugiere que la exploración de la superposición del uso de la información materna y cigótica no necesita limitarse a la condiciones experimentales especiales utilizadas aquí. Estos experimentos requirieron la disponibilidad de una duplicación variada para la región de interés y requirieron un nivel particular de actividad en la duplicación. Aunque otras regiones del genoma podrían ser probadas de la misma manera, es poco probable que estén disponibles muchas duplicaciones con exactamente el grado correcto de variegación. Sin embargo, debería ser posible buscar de novo hipomorfos que respondan a mutantes maternos o heterocigosis por deficiencia.

¿Por qué mueren los hijos mutantes Dp de madres heterocigotas mutantes? Estos resultados implican que la mayoría de los genes de la región zeste-white están activos tanto materna como zigótica, y que ambas fuentes de productos génicos se utilizan para el desarrollo, no sugieren que estos productos génicos sean críticos para un proceso de desarrollo particular. La observación de un defecto en zw3Los mutantes que ocurren no antes de la determinación de los discos imaginales implican, por el contrario, que defectos muy tempranos en la actividad genética pueden resultar en defectos de desarrollo mucho más tardíos. Además, los diversos mutantes zeste-white tienen fases efectivas letales bastante divergentes (SHANNON et al. 1972), aunque la actividad de la mayoría de los genes es necesaria desde el envasado del huevo.

La letalidad causada por defectos maternos parciales parece ser inespecífica. Como se muestra en la Tabla 5, las comparaciones de las interacciones materno-cigóticas encontradas para deficiencias con los productos de las supervivencias de mutantes individuales son generalmente consistentes con efectos acumulativos independientes sobre el bienestar general de los cigotos. Por lo tanto, al igual que con los efectos de la aneuploidía en la supervivencia cigótica (LINDSLEY et Alabama. 1972), La homeostasis general, más que la existencia de funciones críticas individuales, se refleja en la interacción letal maternal-cigótica.

Debería ser útil, al pensar en el papel de los genes en el desarrollo, distinguir la acción de los genes de las acciones e interacciones de los productos de los genes. Se puede sugerir que la actividad génica temprana, y quizás continua, es necesaria para muchos productos que se utilizan de forma continua o se almacenan para su uso posterior (DA-

Comparación de interacciones materno-cigóticas de deficiencias y cistrón único mutaciones

Supervivencia de Df Esperado Loci Zeste-blanco Hombres DLI supervivencia

W rJ2 258-45

1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 0.0

2, 3, 5, 6, 7, 9, 11, 12, 13 0.0

0.0 0.0

Los resultados de deficiencia se toman de ROBBINS (1980), los resultados de mutantes son de la Tabla 4. Supervivencia esperado si los efectos mutantes son independientes se calcula como el producto de los efectos de la mayoría alelos amorfos que se encuentran en los cromosomas libres de mutaciones de confusión. Supervivencias por efecto materno mayor que 1 se tomó como 1.0 para estos cálculos. Todas las comparaciones son para cruces de Dp (14) mg a 25 'salvo que se indique lo contrario.

indicadores fiables del tiempo de actividad genética. Es posible que no reflejen más que la etapa en la que las necesidades de desarrollo superan el nivel de un producto genético almacenado defectuoso. Alternativamente, la fase efectiva letal y / o el período sensible a la temperatura podrían marcar el momento en el que se usa un producto génico almacenado.

¿Los productos genéticos se utilizan continuamente o se almacenan para su uso posterior? Si un producto genético se usa continuamente, tanto la frecuencia de letalidad como el momento de la muerte serían sensibles al nivel y al momento de la actividad genética. En este caso, si se reduce la actividad genética, morirán más moscas y morirán antes. Si a El producto génico se almacena para su uso en un momento determinado, la frecuencia de letalidad, pero no el momento de la muerte, sería sensible al nivel y al momento de la actividad del gen. En ese caso, si se reduce la actividad genética, morirán más moscas, pero, como antes, morirán en el momento en que se necesite el producto genético. La metodología utilizada aquí para exponer las interacciones materno-cigóticas se puede ampliar para discriminar entre estas posibilidades.

La evidencia molecular apunta a una actividad transcripcional bastante general antes y después de la fertilización (DAVIDSON et al. 1982), aunque la diversidad de transcripciones observada podría reflejar la incapacidad para resolver la actividad genética diferencial en diferentes tipos de células. Además, al menos para proteínas abundantes, no se observan cambios importantes en la traducción durante el desarrollo temprano (SAVOINI et al. 1981). Sin embargo, la información molecular no dice nada sobre cómo o cuándo se utilizan los productos génicos. GARCIA-BELLIDO y Moscoso DEL PRADO (1979) han evaluado

Supervivencia embrionaria aumentada en una serie de cruces recíprocos de heterocigotos por deficiencia. Aunque su procedimiento fue menos sensible que la técnica de MuntDp, fueron capaces de identificar una serie de regiones en todo el genoma que contienen genes que codifican funciones maternas y cigóticas superpuestas. Además, una serie de deleciones y mutantes puntuales letales y semiletales ubicados desde la punta del X Se ha probado la función del cromosoma a través de la región salival 11A (mucho más allá de la región zeste-white) durante el desarrollo de la línea germinal (GARCIA-BELLIDO y ROBBINS 1982). La mayoría de los genes examinados en ese experimento son necesarios para la supervivencia de la línea germinal, así como durante el desarrollo cigótico. Aunque las pruebas rigurosas esperan más experimentación, la siguiente hipótesis de trabajo está en orden:

La mayoría de los genes esenciales de Drosophila están activos tanto durante el empaque del huevo no fertilizado como en el embrión en desarrollo (y también durante el desarrollo de la línea germinal). Incluso pueden ser constitutivamente activos durante todo el desarrollo.

Los productos de estos genes, ya sean elaborados en una etapa u otra, no se descartan. En última instancia, se utilizan, ya sea de forma continua o después de acumularse para su uso en una etapa específica o en un tejido en particular. Por lo tanto, esta actividad genética no es simplemente una consecuencia secundaria no utilizada de activar genes "importantes".

No es necesario que la secuencia del desarrollo refleje la actividad secuencial de los genes "del desarrollo", pero puede reflejar una secuencia de transiciones mayores y menores en el uso de productos de genes que, de otro modo, uno estaría tentado a descartar por carecer de importancia para el desarrollo. La transcripción no es el único nivel en el que puede ocurrir la regulación del desarrollo. Cualquiera o todos cf

Los procesos involucrados en el transporte de ARN, la maduración del ARN, la traducción, la modificación postraduccional, la translocación de proteínas, el almacenamiento y el ensamblaje estructural podrían estar involucrados. Si una gran fracción del genoma es constitutivamente activa, deberíamos centrar al menos algo de atención en el uso biológico de la información genética.

Los efectos pueden reflejar heterocigosidad mutante materna e interacciones inespecíficas, en lugar de reguladoras. (THIERRY-MIEG 1982) y el momento de la expresión fenotípica puede reflejar propiedades tanto cuantitativas como cualitativas de la acción de los genes. Estamos muy lejos de comprender la secuencia del desarrollo, pero debemos prestar atención a los genes que son constitutivos, así como a los que están "regulados por el desarrollo".

I Agradezco a NANCY VEENSTRA su ayuda en la realización de estos experimentos ya THOMAS FRIEDMAN, BRUCE MCKEE y ELLEN SWANSON por sus críticas al manuscrito. Investigación apoyada por la National Science Foundation bajo las subvenciones PCM 79-01824 y PCM 82-02662 y por BRSG Grant 2-507 RR07049-15 otorgada por el Programa de Subvenciones de Apoyo a la Investigación Biomédica, División de Recursos de Investigación, Institutos Nacionales de Salud.

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Introducción

Se ha demostrado la extensión de la vida útil mediante la restricción dietética (RD) en una amplia variedad de organismos (Weindruch y Walford, 1988). Sin embargo, es principalmente en roedores donde se ha realizado la mayor parte de la investigación, dejando importantes lagunas en nuestro conocimiento sobre la respuesta a la RD en otras especies. En particular, Drosophila melanogaster es un organismo controvertido con respecto al estudio de la dieta y la longevidad, ya que algunos investigadores consideran a la mosca de la fruta como una excepción al efecto RD (Le Bourg & Minois, 1996 Foley & Luckinbill, 2001). Este malentendido se debe a las muchas lagunas que quedan en la investigación disponible sobre la dieta y el envejecimiento en Drosophila. Si bien se han hecho grandes avances en la utilización de un Drosophila modelo para la disección de la relación genética entre la RD y la longevidad, se carece de nuestro conocimiento de otros aspectos de la respuesta de la mosca a diversas condiciones dietéticas.

A pesar de estos informes contradictorios, la investigación sobre la RD en la mosca de la fruta continúa arrojando hallazgos dignos de mención.La reducción de las calorías de la dieta se ha utilizado con éxito para prolongar la longevidad de hombres y mujeres adultos. Drosophila en una variedad de estudios (Chapman & Partridge, 1996 Rogina et al., 2002). La magnitud de la extensión de la vida útil en respuesta a la RD se acentúa en las moscas hembras, tal vez debido a una interacción adicional con los patrones de fertilidad, que se ven marcadamente alterados por cambios en las condiciones dietéticas (Chapman & Partridge, 1996 Magwere et al., 2004). Además, la respuesta de la esperanza de vida a los cambios en la dieta tiene un fuerte componente genético, con información de la vía de señalización de la insulina y reguladores transcripcionales (Clancy et al., 2002 Pletcher et al., 2002 Rogina et al., 2002 ).

En el curso de estos hallazgos, aspectos más básicos de la Drosophila La respuesta a DR ha sido ignorada. A diferencia de la larga historia de investigación sobre la dieta y la longevidad en roedores, una comprensión fundamental del constructo experimental para los estudios de RD en Drosophila esta falto de. Por lo tanto, ha habido relativamente pocas investigaciones sobre los hábitos alimenticios de Drosophila adultos (Edgecomb et al., 1994 Carey et al., 2002). Asimismo, se ha escrito poco con respecto a la salud relativa y la comparabilidad de las dietas utilizadas en la investigación de RD en moscas. Además, con una preponderancia de la investigación actual que se centra en mutaciones genéticas que modulan el efecto DR y emplean poblaciones exógenas como controles para estas líneas mutantes, estos hallazgos pueden ser difíciles de aplicar a otros proyectos que buscan utilizar el modelo DR en la disección de otros aspectos de la proceso de envejecimiento.

La importancia de tales cuestiones se extiende más allá de la eficacia y la facilidad de aplicación de la RD para impactar la vida útil de los organismos modelo hasta el valor potencial de la RD como herramienta para el estudio de una variedad de procesos que impactan la progresión del envejecimiento. Con ese fin, este informe se centra en las siguientes cuestiones: la magnitud del efecto de la dieta en Drosophila vida útil, el impacto de las calorías de la dieta en la cinética de mortalidad de Drosophila poblaciones y los efectos de la alteración de las calorías de la dieta en fenómenos relacionados con la esperanza de vida, como la fertilidad y los niveles de actividad basal.


Herencia ligada a X

Los cromosomas * que poseen tanto machos como hembras en conjuntos emparejados se denominan autosomas * s. Los cromosomas X e Y que determinan el sexo de un individuo en los mamíferos siguen un patrón diferente y se denominan alosomas * s. Los genes presentes en los cromosomas X e Y se denominan genes ligados al sexo. Los genes ligados al sexo en el cromosoma X son genes ligados al cromosoma X. Los genes del cromosoma Y están ligados a Y.

Las hembras tienen dos cromosomas X. Los machos tienen un cromosoma X y uno Y.

Las hembras tienen dos cromosomas X. Los machos tienen un cromosoma X y uno Y.

Con un cromosoma X e Y, los machos heredan rasgos ligados a X e Y, mientras que las mujeres solo heredan rasgos ligados a X. Dado que los machos tienen solo una copia de cada cromosoma sexual, son hemicigóticos para todos los genes ligados al sexo y siempre expresan el fenotipo * del alelo * que obtienen. En otras palabras, sus fenotipos siempre coinciden con sus genotipos * s.

Las hembras obtienen dos copias de genes ligados al cromosoma X, lo que demuestra los patrones de expresión dominante-recesivos más típicos de los rasgos no ligados al sexo.

Estos patrones hacen que los patrones de expresión de rasgos ligados al sexo difieran entre la descendencia masculina y femenina.

El cromosoma X es más grande y contiene más genes que el cromosoma Y, por lo que la mayoría de los rasgos ligados al sexo son rasgos ligados al cromosoma X.

Las moscas de la fruta de tipo salvaje tienen ojos de color rojo oscuro, pero hay alelos recesivos de este gen del color de los ojos (llamado gen blanco) que hacen que los individuos tengan los ojos blancos. Como rasgo recesivo, el fenotipo del ojo blanco está enmascarado por la presencia de un alelo de tipo salvaje (codificación roja). Si el gen blanco estuviera en un autosoma, exhibiría patrones clásicos de herencia mendeliana. Sin embargo, el gen está en el cromosoma X, lo que lo convierte en una excelente ilustración de los patrones de herencia ligados al sexo.

Seleccione un hombre y una mujer para el P1 generación y haga clic en 'comenzar' para explorar los patrones de herencia del color de ojos en las moscas de la fruta:

Dado que este gen en particular que controla el color de los ojos está en el cromosoma X, las hembras (XX) portan dos copias y los machos (XY) solo portan una. En las mujeres, la presencia de un alelo codificador rojo dominante (X W) producirá ojos rojos incluso si el individuo es heterocigoto para el alelo blanco. Las hembras pueden ser:

  • Homocigoto dominante para el alelo codificante rojo - genotipo: X W X W fenotipo: ojos rojos.
  • Heterocigoto - genotipo X W X w fenotipo: ojos rojos.
  • Homocigoto recesivo con dos alelos codificantes blancos: genotipo X w X w fenotipo ojos blancos.
Tres combinaciones de alelos posibles en mujeres.

Con solo una copia del cromosoma X, todos los hombres son hemicigóticos para este gen. Tienen solo dos opciones:

Dos combinaciones de alelos posibles en los machos.

La observación de la proporción de individuos masculinos y femeninos de ojos rojos y blancos producidos con cruces recíprocos muestra la diferencia entre los patrones de herencia mendeliana clásicos y ligados al sexo. Los cruces recíprocos implican el cruzamiento de individuos de ojos rojos y blancos reproductores verdaderos.

Son posibles dos cruces recíprocos: A) una hembra de ojos rojos de verdadera reproducción con un macho de ojos blancos y B) una hembra de ojos blancos de reproducción verdadera con un macho de ojos rojos.

Al realizar el primer cruce recíproco: una hembra de ojos rojos de verdadera reproducción (dominante homocigoto) con un macho de ojos blancos de reproducción verdadera (hemicigoto recesivo) da como resultado una generación F1 compuesta en su totalidad por individuos de ojos rojos. El 100% de la generación F1 que tiene ojos rojos es consistente con lo que se predeciría en base a la herencia mendeliana de un alelo recesivo. Sin embargo, con un gen ligado al cromosoma X, el motivo de los ojos rojos difiere entre hombres y mujeres.

Toda la descendencia femenina es heterocigótica y recibe un cromosoma X con un alelo rojo de su madre y un cromosoma X con el alelo blanco de su padre. La presencia del alelo rojo de la madre enmascara el alelo blanco. La descendencia masculina solo tiene un cromosoma X, que recibió de su progenitora femenina. Dado que el progenitor femenino es homocigoto, cualquiera que sea el alelo que obtengan los machos, recibirán un alelo de ojos rojos.

Las hembras tienen los ojos enrojecidos porque la presencia de la copia recesiva está enmascarada. Los machos tienen los ojos rojos porque solo tienen una copia del gen, y esa copia es para el alelo rojo.

El fenotipo y el genotipo de las hembras concuerdan con los patrones descubiertos por Mendel, pero los machos, como hemicigotos, no lo son.

Las diferencias entre los sexos se hacen más evidentes en un cruce que utiliza el macho F1 de ojos rojos y las hembras F1 de ojos rojos. Este cruce produce una proporción de 3: 1 de individuos de ojos rojos y de ojos blancos, pero todos los individuos de ojos blancos son hombres. Ninguna mujer tiene los ojos blancos porque recibió uno de sus cromosomas X de su padre hemicigótico dominante de ojos rojos. Todos los descendientes masculinos recibieron su único cromosoma X del progenitor femenino heterocigoto, por lo que la mitad recibió un alelo rojo y la otra mitad un alelo blanco.

Primeras tres generaciones del primer cruce recíproco.

Los patrones de herencia con el otro cruzamiento recíproco (hembra homocigota recesiva con macho dominante hemicigoto) divergen del patrón mendeliano más rápidamente. La generación F1 contiene una proporción igual de individuos de ojos blancos y rojos, pero todos los machos tienen ojos blancos y todas las hembras tienen ojos rojos.

Primeras tres generaciones de la segunda cruz recíproca.

Cruzar estos F1 nuevamente da como resultado una proporción de 1: 1 de individuos de ojos rojos y blancos, pero en el F2, la mitad de la descendencia femenina y la mitad de la descendencia masculina tienen ojos rojos.

En ambos cruces recíprocos, los patrones de herencia más allá de la generación F2 varían dependiendo de qué individuos F2 se eligen para el cruzamiento.

Los fenotipos recesivos ligados al cromosoma X se observan con mayor frecuencia en los hombres porque los hombres son hemicigóticos para los rasgos ligados al sexo. Las hembras pueden ser heterocigotas para un rasgo y, por lo tanto, portan el alelo recesivo sin expresarlo. Estas hembras portadoras tienen un 50% de posibilidades de transmitir los alelos recesivos a sus descendientes masculinos. Estos descendientes masculinos no pueden ser portadores. Si reciben el alelo recesivo, expresarán el rasgo recesivo.

Las hembras que expresan rasgos recesivos perjudiciales como la hemofilia son particularmente raras porque la única forma de que una hembra sea más que portadora es que una portadora produzca una hija con un macho afectado. El caso extremo de un apareamiento de una hembra afectada con un macho afectado produce un 100% de descendencia afectada.

Ponga a prueba su comprensión de los patrones discutidos anteriormente con el gen ligado al cromosoma X, complete el espacio en blanco y preguntas de opción múltiple


Investigar

Soy un genetista evolutivo que está interesado en las propiedades generales de los sistemas genéticos más que en la historia o función de genes específicos.

Hago preguntas como: ¿Son los descendientes de origen sexual más aptos que los descendientes de origen asexual (y por qué)? ¿Las tasas de mutación y recombinación cambian con la condición? Si es así, ¿por qué importaría? ¿Hasta qué punto las poblaciones están cargadas por alelos deletéreos? ¿Cómo afectan los factores ecológicos y genéticos a esta carga? Abordo estos problemas tanto teórica como empíricamente utilizando varios sistemas biológicos, incluida la poderosa mosca de la fruta, Drosophila melanogaster (aquí se muestran algunos mutantes geniales). Nuestro trabajo empírico abarca enfoques experimentales clásicos de la genómica evolutiva moderna.

Sexo y mezcla genética usando teoría, experimentos y genómica

En teoria:La mayoría de las plantas y animales se reproducen sexualmente en lugar de asexualmente, pero ¿por qué es así? ¿Por qué los organismos deben mezclar continuamente sus genomas? Este es uno de los grandes problemas pendientes de la biología evolutiva. Cuando los organismos se reproducen sexualmente, dos procesos genómicos, la segregación y la recombinación, permiten la mezcla de genes y la producción de genotipos descendientes diferentes a los parentales. ¿Cómo contribuyen estos diferentes procesos a la evolución de la mezcla genética? [PDF] Estoy interesado en comprender las ventajas de la segregación y la recombinación a nivel de grupo y de gen. Debido a que se han presentado una variedad de ideas diferentes como posibles soluciones al desconcertante problema de & # 8220 ¿por qué el sexo? & # 8221, este trabajo ha generado un interés en varias áreas relacionadas, incluida la carga de mutación, la coevolución huésped-parásito y la plasticidad en Procesos genómicos. Los modelos teóricos nos permiten evaluar de manera más rigurosa ideas sobre qué mantiene el sexo y cuáles son las consecuencias de tener poco o ningún sexo. El modelado teórico es el primero de varios enfoques que utilizamos para estudiar el sexo.

La mayoría de las plantas y animales se reproducen sexualmente en lugar de asexualmente, pero ¿por qué es así? ¿Por qué los organismos deben mezclar continuamente sus genomas? Este es uno de los grandes problemas pendientes de la biología evolutiva. Cuando los organismos se reproducen sexualmente, dos procesos genómicos, la segregación y la recombinación, permiten la mezcla de genes y la producción de genotipos descendientes diferentes a los parentales. ¿Cómo contribuyen estos diferentes procesos a la evolución de la mezcla genética? [PDF] Estoy interesado en comprender las ventajas de la segregación y la recombinación a nivel de grupo y de gen. Debido a que se han presentado una variedad de ideas diferentes como posibles soluciones al desconcertante problema de & # 8220 ¿por qué el sexo? & # 8221, este trabajo ha suscitado un interés en varias áreas relacionadas, incluida la carga de mutaciones, la coevolución huésped-parásito y la plasticidad en Procesos genómicos. Los modelos teóricos nos permiten evaluar de manera más rigurosa ideas sobre qué mantiene el sexo y cuáles son las consecuencias de tener poco o ningún sexo. El modelado teórico es el primero de varios enfoques que utilizamos para estudiar el sexo.

Con rotíferos: Los estudios de laboratorio nos permiten probar elementos de la teoría en sistemas reales mantenidos en condiciones bien controladas (aunque artificiales). Hace varios años iniciamos un programa experimental utilizando el rotífero facultativamente sexual Brachionus calyciflorus(en la foto aquí) para probar las predicciones teóricas sobre los tipos de condiciones que favorecen el aumento de las tasas de sexo. Por ejemplo, recientemente hemos confirmado experimentalmente una predicción teórica clásica de que se favorecen tasas más altas de sexo durante la adaptación [PDF]. Utilizando manipulaciones adicionales que diseccionan los mecanismos genéticos poblacionales que favorecen el sexo. Estos resultados revelaron que el sexo se ve favorecido, como predice la teoría, porque los alelos de alto sexo se asocian con alelos adaptativos en lugar de porque el sexo está creando combinaciones de genes beneficiosos. per se. Seguimos utilizando rotíferos para probar otros aspectos de la teoría para el mantenimiento del sexo, así como la teoría de las consecuencias de evolucionar sin ningún sexo.

Con lenteja de agua: La teoría y los experimentos de laboratorio iluminan los principios básicos pero, en última instancia, nos esforzamos por comprender la selección en el sexo y las consecuencias del sexo alto y bajo en los sistemas naturales. En colaboración con Stephen Wright, hemos comenzado recientemente a estudiar un grupo de plantas facultativamente sexuales, la lenteja de agua (pequeñas plantas acuáticas de crecimiento rápido). Estamos utilizando la genómica de poblaciones para estimar la frecuencia de reproducción sexual en diferentes poblaciones y en diferentes especies. También estamos utilizando la inferencia genética de poblaciones para cuantificar la eficiencia de la selección en todo el genoma y preguntar si las poblaciones o especies que son más sexuales muestran tasas más altas de adaptación y / o una menor frecuencia de alelos deletéreos. Como parte de la base de nuestra inferencia de genómica poblacional, estamos realizando experimentos para medir las tasas de recombinación, mutación y conversión de genes. Además de la genómica, investigaremos las consecuencias del sexo en la aptitud física en el campo. Nuestro objetivo es no solo inferir los mecanismos genéticos de la población que mantienen el sexo, sino que esperamos poder obtener conocimientos sobre los agentes ecológicos de la selección a través de experimentos de campo manipuladores.

Biología evolutiva de mutaciones perjudiciales

La mutación es la fuente última de variación genética, pero la gran mayoría de las nuevas mutaciones son perjudiciales. Estas mutaciones deletéreas reducen la aptitud media, un fenómeno conocido como carga de mutación (ver revisión). La carga de mutaciones puede ser sustancial. Por ejemplo, bajo las suposiciones más simples, la teoría clásica predice que las mutaciones deletéreas reducirán la aptitud media en más del 60% si, en promedio, hay una sola mutación deletérea por genoma por generación. Debido a la posibilidad de que las mutaciones tengan efectos tan importantes en la aptitud media, los biólogos han postulado que las mutaciones deletéreas pueden ser un factor clave subyacente a una amplia variedad de fenómenos importantes que incluyen la extinción de poblaciones, el mantenimiento de la varianza genética, la evolución de la reproducción sexual y la evolución del tamaño y la complejidad del genoma. Debido a que los alelos deletéreos afectan la salud de los individuos y reducen la productividad de las poblaciones, los alelos deletéreos también son importantes con respecto a cuestiones aplicadas como la salud pública, la conservación y la gestión de los recursos biológicos. Estoy interesado en comprender el proceso mutacional en sí mismo y si podemos aprender principios generales sobre cómo la selección elimina los alelos deletéreos.

Tasas y espectros de mutación
Solo recientemente ha sido posible obtener buenas estimaciones de la tasa de mutación y sabemos poco sobre la variación en la tasa de mutación. Tanto por razones evolutivas como de salud pública, me ha interesado particularmente la posibilidad de que las personas con mala salud puedan tener tasas elevadas de mutación. Usando moscas de la fruta, hemos encontrado que las hembras en condiciones bajas tienen una capacidad reducida para reparar el daño del ADN (disponible en PLoS aquí) y que las moscas en condiciones bajas vs. . En otro estudio, encontramos evidencia de que las moscas con genotipos de baja calidad parecen experimentar tasas elevadas de mutación [PDF]. Ahora estamos usando datos genómicos para descubrir qué tipos de mutaciones (por ejemplo, sustituciones de pares de bases, indeles) ocurren con más frecuencia en moscas de baja calidad frente a moscas de alta calidad.

Selección de mutaciones deletéreas
La frecuencia de los alelos deletéreos depende de la velocidad con la que entran en una población por mutación, pero también de la fuerza de selección mediante la cual se eliminan. Hay muchos ejemplos que demuestran que la selección de mutaciones particulares depende del contexto, pero mi grupo está interesado en saber si existen principios generales sobre la selección. ¿Son ciertos entornos más selectivos que otros? Si es así, ¿por qué? ¿En qué medida los efectos mutacionales dependen del trasfondo genético en el que se miden? ¿Importa si el trasfondo genético está adaptado al medio o no? En un estudio reciente, descubrimos que la selección contra un conjunto de mutaciones en las moscas se veía afectada por el entorno, pero no por si el trasfondo genético estaba adaptado a ese entorno o no [PDF]. A partir de una revisión de la literatura [PDF], encontramos poco apoyo para la idea de que el estrés aumenta la selección media, pero hubo evidencia indirecta de que la competencia dependiente de la densidad podría ser importante. Motivados por esto, recientemente medimos la selección contra genotipos consanguíneos (es decir, depresión endogámica) en 22 ambientes, caracterizados tanto por el estrés como por la dependencia de la densidad, encontrando que este último era un mejor predictor de la selección (Yun y Agrawal, en prensa).

Selección sexual y mutaciones deletéreas
Es probable que la mayoría de las mutaciones sean perjudiciales tanto en hombres como en mujeres. En los machos, gran parte del efecto de aptitud se puede producir mediante la reducción del éxito de apareamiento. Por esta razón, la selección sexual puede ser una fuerza poderosa que ayude a purgar los alelos deletéreos. De hecho, hemos descubierto que la selección en las moscas es más fuerte en los machos que en las hembras en las mutaciones de marcadores fenotípicos [PDF] y mutaciones espontáneas [PDF]. Además, hemos descubierto que la aptitud masculina es más sensible a la condición que la aptitud femenina en varios entornos de ensayo diferentes que varían en la disponibilidad de recursos clave [PDF]. Resultados como estos sugieren que la selección sexual debería ayudar a eliminar los alelos deletéreos, pero otros han encontrado evidencia de que la selección sexual puede obstaculizar la selección natural en las hembras si los machos acosan preferentemente a las hembras de buena calidad. Con Howard Rundle (U Ottawa), hemos estado explorando si el campo de las interacciones de apareamiento controla el equilibrio entre la selección sexual y los efectos positivos sobre la selección masculina frente a sus efectos negativos sobre la selección femenina.

Otros intereses

Mis otros intereses de investigación incluyen el mantenimiento de la varianza genética, el antagonismo sexual y la evolución del dimorfismo sexual, la coevolución huésped-parásito y la genética de la especiación. Además de estos temas, estoy interesado en muchos otros aspectos de la genética de poblaciones.


Agradecimientos

Agradecemos a L. D. Mueller por sus inmensamente útiles comentarios sobre el manuscrito. Agradecemos al Instituto Indio de Educación e Investigación Científica Mohali y al Departamento de Ciencia y Tecnología del Gobierno. de la India por la financiación continua del proyecto. También estamos agradecidos con Pratip Chakraborty y Vinesh Shenoi por su ayuda en el laboratorio. BN y VG agradecen al Consejo de Investigación Científica e Industrial, Govt. de la India, por la asistencia financiera en forma de Beca de Investigación Senior y ZSA agradece al Consejo de Investigación Científica e Industrial, Govt.de la India, para obtener ayuda financiera en forma de una beca de investigación para jóvenes. MAS y SS agradecen al Departamento de Ciencia y Tecnología, Govt. de la India para la beca INSPIRE. NU agradece a la Academia India de Ciencias, Gob. de la India para recibir apoyo financiero en forma de Beca de Investigación de Verano.


Ver el vídeo: ALTERACIONES O MUTACIONES GENÓMICAS 4º ESO (Mayo 2022).