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9: Autoensamblaje - Lípidos, membranas - Biología

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Clase 10. Autoensamblaje: lípidos, membranas

Lectura y problemas: LNC pág. 1, 2, 7, 9, 11, 12

I. Lípidos - moléculas "pequeñas" celulares hidrofóbicas - componentes no proteicos de las células que se dividen en disolventes orgánicos como xileno o hexano.

UNA. Ácidos grasos: ácidos carboxílicos de cadena larga; afipático (que tiene regiones hidrófobas e hidrófilas en una molécula); las sales de FA son jabones; formar micelas en soluciones acuosas (la estructura de una micela se puede ver en este sitio). Las propiedades de los ácidos grasos están determinadas por la longitud de la cadena y el número de insaturaciones.

B. Triglicéridos (triacilgliceroles): tres cadenas FA unidas a un esqueleto de glicerol mediante enlaces éster. Se denominan grasas (si son en su mayoría saturadas y sólidas a temperatura ambiente) o aceites (si la insaturación los hace líquidos a temperatura ambiente). Se utiliza principalmente para almacenamiento de energía.

C. Glicerofosfolípidos: columna vertebral de glicerol con dos cadenas FA y un fosfato (que puede tener grupos funcionales adicionales unidos). Una clase importante de lípidos de membrana. Formará espontáneamente bicapas o liposomas en ambiente acuoso.

MI. Colesterol. En membranas de animales. Amplía la curva de fusión de la membrana, lo que permite el mantenimiento de la fluidez adecuada en un rango de temperaturas.

A. Modelo de mosaico fluido de membranas

1. Proteínas integrales de la membrana: solo se pueden eliminar de la membrana mediante métodos que conduzcan a la disolución de la membrana. Las superficies de las proteínas en contacto con el interior de la membrana son hidrófobas.

2. Proteínas de la membrana periférica: pueden eliminarse con sal u otros tratamientos que dejan la membrana prácticamente intacta. Puede unirse a la superficie de proteínas integrales de la membrana, entrar parcialmente en la membrana o estar anclado por moléculas lipídicas unidas (por ejemplo, prenilación).

C. Las valvas internas y externas de las membranas pueden tener una composición diferente.

D. El movimiento lateral de las membranas es rápido, el movimiento entre las valvas (volteo) es lento.

Algunos se llevan información a casa

Glicerolípidos - tener una columna vertebral de glicerol
Esfingolípidos - tiene una columna vertebral de esfingosina
Fosfolípidos - incluir un grupo fosfato
Glucolípidos - tienen residuos de azúcar adheridos
Otro vocabulario: anfipático, micela, liposoma, éster, vesícula, sonicación, vórtex, etanolamina, colina

Vea las estructuras que se pueden ver bajo el encabezado "2. Lípidos" en esta página, haga clic en el botón "JSmol" y no necesitará Java para ver las estructuras.

Colaboradores

  • Charles S. Gasser (Departamento de Biología Molecular y Celular; UC Davis)


Título: Autoensamblaje de anfífilos de aramida en nanocintas ultraestables e hilos de nanocintas alineados

El autoensamblaje de moléculas pequeñas es una ruta establecida para producir nanoestructuras de gran superficie con químicas fácilmente personalizables y una organización molecular precisa. Sin embargo, estas estructuras son frágiles, exhiben intercambio molecular, migración y reordenamiento, entre otras inestabilidades dinámicas, y finalmente se disocian al secarse. Aquí mostramos una plataforma de molécula pequeña, el anfífilo de aramida (AA), que supera estas inestabilidades dinámicas incorporando un dominio inspirado en Kevlar en la estructura molecular. Las interacciones anisotrópicas fuertes entre los AA suprimen el intercambio molecular y provocan el autoensamblaje espontáneo en el agua para formar nanocintas con longitudes de hasta 20 micrones. Las nanocintas tienen un módulo de Young de 1,7 GPa y una resistencia a la tracción de 1,9 GPa. Aprovechamos esta estabilidad para extender el autoensamblaje de moléculas pequeñas a materiales macroscópicos ordenados jerárquicamente fuera de los entornos solvatados. A través de un proceso de alineación por cizallamiento acuoso, organizamos nanocintas AA en hilos flexibles arbitrariamente largos que soportan 200 veces su peso cuando se secan. Las pruebas de tracción de los hilos proporcionan un punto de referencia para los módulos de Young (entre

400 y 600 MPa) y extensibilidades (entre

0,6 y 1,1%) que dependen de la química del contraión en solución. Este enfoque de abajo hacia arriba para los materiales macroscópicos podría beneficiar a las aplicaciones de estado sólido, históricamente inaccesibles para los nanomateriales autoensamblados.

Formatos de cita

400 y 600 MPa) y extensibilidades (entre

0,6 y 1,1%) que dependen de la química del contraión en solución. Este enfoque de abajo hacia arriba para los materiales macroscópicos podría beneficiar a las aplicaciones de estado sólido, históricamente inaccesibles para los nanomateriales autoensamblados.>,
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Obras referenciadas en este registro:


Introducción

El autoensamblaje es la piedra angular del funcionamiento de los sistemas biológicos, lo que da como resultado la síntesis de conjuntos macromoleculares complejos que contienen componentes de proteínas, ácidos nucleicos, lípidos y carbohidratos. Las máquinas celulares resultantes proporcionan la síntesis, el transporte y el procesamiento de información y energía. Un ejemplo, que juega un papel crítico en la salud humana, es la colección de partículas de lípidos y proteínas que transportan el colesterol y los ésteres de colesterol entre la vasculatura y órganos como el hígado y los tejidos esteroidogénicos. Los jugadores importantes en este proceso son las lipoproteínas de alta densidad. Estas partículas a nanoescala, que constan principalmente de una sola proteína, Apo-AI y lípido, se transforman de una forma discoidal optimizada para lípidos en una bola esférica a medida que se carga el éster de colesterol (Koppaka, 2001 Marcel y Kiss, 2003 Zannis et al., 2006). Si bien es importante para enfermedades humanas como la aterosclerosis, hace casi una década se observó que la forma discoidal de las partículas de HDL podría utilizarse para proporcionar una bicapa de fosfolípidos soportada soluble para la incorporación de proteínas de membrana (Bayburt et al., 1998 2000 Bayburt y Sligar, 2002 2003 Civjan et al., 2003). Este proceso da como resultado que la proteína de membrana diana se encuentre en su entorno lipídico similar al nativo con & # x02018 presentación natural & # x02019, pero soluble en solución acuosa (Sligar, 2003 Nath et al., 2007). La realización de partículas homogéneas y monodispersas como punto final requirió una extensa ingeniería de proteínas de la proteína Apo-AI circundante, lo que resultó en una clase de péptidos anfipáticos denominados proteínas de andamio de membrana (MSP) (Bayburt et al., 2002) y las correspondientes partículas bicapa discoidales con un diámetro de 10 & # x0201312 nm y un grosor de 4,5 & # x020135,5 nm, denominadas Nanodiscs (Bayburt et al., 2002 Denisov et al., 2004). La modificación de la secuencia de MSP permitió posteriormente la incorporación de etiquetas de afinidad (Histidina, FLAG, etc.), que podrían eliminarse mediante tratamiento con proteasa (Factor X, TEV), así como disposiciones para el etiquetado específico del sitio de tipos de aminoácidos únicos diseñados. El uso de tecnología de genes sintéticos dio como resultado la capacidad de producir MSP en E. coli a nivel de gramo. Como se revisó recientemente (Nath et al., 2007 Bayburt y Sligar, 2010 Denisov y Sligar, 2010), incorporación exitosa de proteínas de membrana completamente funcionales, como bacteriorrodopsina monomérica o trimérica, rodopsina bovina monomérica y dimérica, citocromos de mamíferos P450 y sus complejos con la citocromo P450 reductasa y diversas transmembrana Los receptores se pueden lograr utilizando el autoensamblaje a partir de la mezcla de MSP solubilizada en colato, lípidos y proteína diana.

Está surgiendo una comprensión biofísica del proceso de autoensamblaje a través de la combinación de dispersión de rayos X en solución y métodos computacionales (Shih et al., 2007a, b). Incluso para nanopartículas sin dianas proteicas de membrana incorporadas, esto implica el ensamblaje de dos MSP distintas junto con cientos de fosfolípidos, el número exacto determinado por el tipo de fosfolípido (Bayburt et al., 2002 Denisov et al., 2004 Denisov et al., 2005). En esta comunicación documentamos un enfoque de ingeniería de proteínas para generar Nanodisc con tamaños más grandes, 16 & # x0201317 nm. Los esfuerzos anteriores de simplemente fusionar dos copias de un solo MSP dieron como resultado preparaciones menos monodispersas y un bajo rendimiento de partículas grandes de lipoproteínas (Bayburt et al., 2002). Nuestros resultados actuales incorporan conocimiento sobre exactamente qué hélices de la secuencia madre Apo-AI están realmente formando contacto con las cadenas de lípido acilo, y se basan en la experiencia previa en la ingeniería de fusiones de estas proteínas de andamio (Bayburt et al., 2002 Denisov et al., 2004) y sobre optimización de condiciones para la generación de discos con diámetros hasta 17 nm. Este descubrimiento sobre cómo producir nanodiscos de tamaño creciente es de gran valor para la incorporación de complejos moleculares más grandes, como las enzimas involucradas en el metabolismo energético celular, oligómeros de receptores de membrana integral, canales iónicos y proteínas transportadoras.


Abstracto

El autoensamblaje de lipoproteínas discoidales de alta densidad reconstituidas, conocidas como nanodiscos, se estudió utilizando dinámica molecular de grano grueso y dispersión de rayos X de ángulo pequeño. En los seres humanos, las partículas de lipoproteínas de alta densidad transportan el colesterol en la sangre y facilitan la eliminación del exceso de colesterol del organismo. La lipoproteína nativa de alta densidad exhibe una amplia variedad de formas y tamaños, formando partículas esféricas maduras, discoidales nacientes y libres de lípidos / pobres. Se sabe poco sobre cómo estas partículas de lipoproteínas se ensamblan y se transforman de un estado a otro. Múltiples simulaciones de grano grueso de 10 μs revelan el ensamblaje de partículas de lipoproteínas de alta densidad discoidales a partir de complejos desordenados de proteínas y lípidos. Los patrones de dispersión de rayos X de ángulo pequeño se calcularon a partir de las estructuras ensambladas finales y se compararon con las mediciones experimentales realizadas para este estudio para verificar la precisión de las simulaciones de grano grueso. Los resultados muestran que las interacciones hidrofóbicas ensamblan, en varios microsegundos, las proteínas helicoidales anfipáticas y los lípidos en partículas aproximadamente discoidales, mientras que las proteínas asumen una configuración final aproximada de doble cinturón en una escala de tiempo más lenta.


Abstracto

Demostramos que las proteínas de membrana y los fosfolípidos pueden autoensamblarse en arreglos poliédricos adecuados para el análisis estructural. Utilizando el Escherichia coli canal mecanosensible de pequeña conductancia (MscS) como proteína modelo, preparamos nanopartículas poliédricas de proteína de membrana (MPPN) con radios uniformes de ~ 20 nm. El análisis criotomográfico electrónico estableció que estos MPPN contienen heptámeros de 24 MscS relacionados por simetría octaédrica. La subsiguiente criomicroscopía electrónica de una sola partícula produjo una reconstrucción a una resolución de ∼1 nm, revelando una conformación que se asemeja mucho al estado no conductor. La generalidad de este enfoque se ha abordado mediante la preparación exitosa de MPPN para dos proteínas no relacionadas, el canal mecanosensible de gran conductancia y la conexión Cx26, utilizando un sistema de difusión de interfaz libre basado en microfluídicos recientemente diseñado. Las MPPN proporcionan no solo un punto de partida para el análisis estructural de proteínas de membrana en un entorno de fosfolípidos, sino que sus superficies cerradas deberían facilitar los estudios en presencia de gradientes transmembrana fisiológicos, además de posibles aplicaciones como portadores de administración de fármacos o como plantillas para la formación de nanopartículas inorgánicas. .

Las funciones de muchas proteínas de membrana están íntimamente ligadas a la generación, utilización y / o detección de gradientes transmembrana (1). A pesar de los avances en la determinación de la estructura de las proteínas de membrana (2), el análisis estructural de alta resolución de las proteínas de membrana en una membrana biológica es poco común y, en presencia de un gradiente funcionalmente relevante, sigue siendo un desafío experimental aún no realizado. Esto se debe al hecho de que las muestras primarias ordenadas en 2D y 3D utilizadas en estudios estructurales de proteínas de membrana mediante cristalografía de rayos X y microscopía electrónica carecen de superficies de membrana cerradas, lo que hace imposible establecer gradientes transmembrana fisiológicamente relevantes.

Como alternativa, hemos estado desarrollando metodologías para el autoensamblaje de lípidos y proteínas de membrana en estructuras poliédricas cerradas que potencialmente pueden soportar gradientes transmembrana para estudios estructurales y funcionales. La posibilidad de generar arreglos poliédricos de proteínas de membrana en proteoliposomas fue motivada por la existencia de cápsides poliédricas de virus envueltos en membrana (3, 4), la capacidad de las mezclas de surfactantes para autoensamblarse en estructuras poliédricas (5, 6) y la formación de proteoliposomas a partir de membranas nativas que contienen bacteriorrodopsina (7, 8) y complejo de captación de luz II (LHCII) (9). De manera significativa, la estructura de alta resolución de LHCII se determinó a partir de cristales de proteoliposomas icosaédricos compuestos por subunidades de proteínas en los lípidos del cloroplasto (10). Mientras que las proteínas de membrana solubilizadas con detergente y las mezclas de lípidos pueden autoensamblarse para formar láminas cristalinas ordenadas en 2D o tubos helicoidales favorables para la determinación de la estructura por microscopía electrónica (11 ⇓ ⇓ –14), los ensamblajes ordenados poliédricos simples solo se han descrito para formar a partir de una selección nativa membranas (7 ⇓ –9). Para ampliar el repertorio de métodos estructurales de proteínas de membrana, hemos preparado nanopartículas poliédricas de proteínas de membrana (MPPN) del canal mecanosensible bacteriano de pequeña conductancia (MscS) (15, 16) a partir de fosfolípidos y proteínas solubilizadas con detergente, y hemos demostrado que son susceptibles de análisis estructural mediante microscopía electrónica.

Se anticipó que las condiciones para generar MPPN se asemejarían a las de otros tipos de disposiciones bicapa ordenadas en 2D de proteínas de membrana, particularmente cristales 2D, en que la proteína de membrana se mezcla con un fosfolípido particular en una proporción definida, seguida de diálisis para eliminar el detergente solubilizante ( 17). La principal distinción es que debido a que los MPPN son poliédricos, se buscan condiciones que estabilicen las superficies altamente curvas de los poliedros en lugar de las muestras planas (planas) deseadas para los cristales 2D. Usamos el Escherichia coli MscS como sistema modelo. MscS es un canal intrínsecamente activado por estiramiento identificado por Booth y colaboradores (15) que confiere resistencia a la descarga osmótica en E. coli. MscS forma un canal heptamérico con 21 hélices transmembrana (3 de cada subunidad) y un gran dominio citoplasmático con dimensiones generales de ∼8 × ∼12 nm paralelos y perpendiculares al plano de la membrana se han reportado estructuras tanto en estructuras no conductoras (16, 18) como en conformaciones de estado abierto (19). Se agregaron diferentes fosfolípidos para purificar el E. coli MscS se solubilizó en el detergente Fos-Choline 14 y se dejó que el sistema alcanzara el equilibrio por diálisis a diferentes temperaturas. Para obtener información sobre los parámetros biofísicos que gobiernan la formación de MPPN, investigamos el papel del grupo de cabeza de lípidos, la longitud de la cadena de alquilo, el pH y la construcción de proteínas. La Tabla S1 muestra la influencia observada de estos diversos factores en nuestra capacidad para formar MPPN uniformes (en contraposición a agregados desordenados o proteoliposomas polidispersos). Las condiciones óptimas para la formación de MPPN utilizaron 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfocolina [añadida a ∼1: 0,1 (peso / peso) de proteína: fosfolípido] a pH 7 con la MscS marcada con His que se prevé que esté cargada positivamente en estas condiciones. Las propiedades biofísicas de la proteína son importantes, ya que los mejores resultados se lograron utilizando una construcción etiquetada con His y la presencia de una etiqueta FLAG en el extremo C de MscS interfirió con la formación de MPPN, aunque la etiqueta está a ∼10 nm de la membrana. que abarca la región de MscS.

Para monitorear la formación de MPPN, se utilizó dispersión dinámica de luz (DLS). En condiciones óptimas, observamos (Fig.1A) la transición completa de partículas MscS solubilizadas con una distribución estrecha centrada alrededor de un radio medio de 4,5 nm a MPPN con una distribución estrecha centrada alrededor de un radio medio de 20 nm. Además, caracterizamos estas partículas mediante microscopía electrónica de tinción negativa. Figura 1B es una micrografía electrónica de tinción negativa de vista de campo de una solución de MscS solubilizado con detergente y lípido antes del inicio del proceso de autoensamblaje. Figura 1C es una micrografía electrónica de tinción negativa de vista de campo de la misma muestra después del proceso de autoensamblaje. Observamos la incorporación de MscS en poliedros altamente uniformes con radios medios de ~ 20 nm (90%) y ~ 17 nm (10%) mediante microscopía electrónica de tinción negativa. Para obtener más información sobre las propiedades biofísicas de estas partículas, realizamos análisis de proteínas y fósforo en múltiples muestras para determinar la relación lípido: proteína (Fig. S1). La relación lípido: proteína observada de las MPPN de MscS fue 11 ± 1 (subunidad de lípido molar: proteína molar) y consistente con una única capa de lípidos que forma una bicapa que rodea cada proteína. Esta relación es comparable a la relación lípido / proteína observada que se encuentra en cristales 2D de proteínas de membrana como bacteriorrodopsina (relación lípido: proteína de 10 refs. 20 y 21) y acuaporina (relación lípido: proteína de 9 ref. 22).

Preparación de MscS MPPN. (A) Análisis DLS de partículas antes de la diálisis y después de completar la diálisis cuando se forman MPPN. El radio observado de MscS solo fue de 4,5 nm y se observó que el radio de las partículas al final de la diálisis era de 20 nm. En ambos casos se observó el 99% de la masa de dispersión en las distribuciones centradas en 4,5 nm y 20 nm, respectivamente. (B) Análisis de microscopía electrónica de tinción negativa de MscS antes de la diálisis. Las proteínas MscS individuales se pueden observar como pequeñas partículas en forma de rosquilla. (C) Análisis de microscopía electrónica de tinción negativa de MPPN después de la diálisis de la muestra en B. Las MPPN se pueden observar claramente y aparecer como conjuntos uniformes de moléculas de MscS individuales. (Barras de escala, 100 nm.)

Para dilucidar aún más la naturaleza estructural de estas partículas y determinar de manera inequívoca la simetría, realizamos criotomografía electrónica con reconstrucción de imágenes utilizando IMOD (23) combinado con el programa de estimación de partículas para tomografía electrónica (PEET) (ref.24 y Materiales y métodos SI).En principio, la tomografía electrónica proporciona un mapa 3D completo de las partículas y nos permitiría determinar sin ambigüedades la simetría MPPN. Sin embargo, el proceso de alineación estuvo altamente sesgado por el fenómeno de la cuña faltante (24) debido a una señal deficiente: ruido y resultó en un mapa incompleto (Fig.2A). Para superar este sesgo de alineación, asignamos valores de orientación iniciales aleatorios a todas las partículas y restringimos los posibles cambios angulares a menos de 30 ° para lograr una distribución más uniforme de las orientaciones (Fig. S2). Esta estrategia resultó en un mapa de densidad mucho mejor (Fig.2B) que revelaron moléculas individuales con un tamaño y forma que concuerdan bien con la estructura molecular conocida de MscS (Fig.2C y Fig. S3). Sobre la base del análisis de Haselwandter y Phillips (25), se realizó un análisis sistemático (Tabla S2) de las relaciones de simetría entre MscSs en MPPNs que identificaron la disposición correspondiente al cuboctaedro chato (dextro), un sólido de Arquímedes. El cuboctaedro chato tiene una simetría cúbica (octaédrica) que, como lo reconocen Crick y Watson (26), proporciona una forma eficiente de empaquetar partículas idénticas en una capa convexa cerrada. En esta disposición particular, las moléculas de 24 MscS están relacionadas por los ejes de simetría de grupo de 432 puntos que pasan a través de las caras, pero no de los vértices, del cuboctaedro chato. Debido a que las moléculas de MscS se colocan en los vértices de este poliedro quiral, ocupan posiciones generales que permiten el empaquetamiento ordenado de los heptámeros de una biomacromolécula (o de cualquier tipo de partícula). Esta es una observación importante, ya que significa que las moléculas de MscS individuales con simetría séptuple son capaces de empaquetarse en un ensamblaje simétrico que es susceptible de promediar. Mientras que 24 objetos se pueden organizar con entornos idénticos en un cuboctaedro chato, también se pueden acomodar ciertos múltiplos enteros de este número utilizando los principios de cuasiequivalencia (27, 28) para formar capas cerradas más grandes.

Criotomografía de MPPN de MscS. (A) La isosuperficie de PEET derivada de 162 partículas individuales seleccionadas de ocho tomogramas de inclinación única. El fuerte sesgo debido a la cuña faltante se observa a lo largo de la parte inferior de la superficie, pero los heptámeros de MscS individuales aún son discernibles en la imagen. (B) La isosuperficie de PEET correspondiente, tras la introducción de ángulos de Euler iniciales aleatorizados para minimizar el sesgo de cuña faltante. (C) El uso de ángulos de Euler iniciales aleatorizados da como resultado un mapa muy mejorado con simetría octaédrica aparente (432) que podría encajar con 24 moléculas de la estructura cristalina de MscS. Se generaron representaciones isosuperficiales de los promedios de volumen utilizando Chimera (31).

Utilizando la simetría derivada de la criotomografía electrónica, procedimos a recopilar datos de criomicroscopía electrónica de una sola partícula de alta resolución. Se tomaron imágenes de muestras preparadas de forma idéntica para criotomografía en condiciones de dosis baja y se procesaron un total de 4564 partículas utilizando el paquete de software Electron Micrograph Analysis 2 (EMAN2) (Materiales y métodos SI) (29). El mapa final tenía una resolución de 9 Å por correlación de capa de Fourier (Fig. S4) y nos permitió modelar las hélices internas y externas del poro transmembrana (Fig. 3). La disposición de las hélices se parece más a la conformación no conductora (16, 18) que a la estructura de estado abierto (19), aunque algunas diferencias en la posición de las hélices externas con respecto a la estructura no conductora se indican en las secciones 2 y 3 de la Fig. 3. Estos resultados demuestran que las proteínas de membrana son capaces de ensamblarse en MPPN que son susceptibles de análisis de estructura de alta resolución mediante criomicroscopía electrónica de una sola partícula. Sin embargo, se requerirán datos de mayor resolución para detallar las diferencias conformacionales precisas entre MscS en el entorno de fosfolípidos de las MPPN en comparación con las que se encuentran en el estado solubilizado con detergente utilizado en los análisis de la estructura cristalina de rayos X.

Análisis de imagen de una sola partícula reconstruida a partir de 4564 partículas procesadas con EMAN2 y, posteriormente, se extrajo la densidad que rodea a un solo heptámero de MscS y se promedió siete veces como se describe en Materiales y métodos SI. (Izquierda) Una sección transversal a través de la densidad electrónica que revela la vía de translocación y el vestíbulo citoplasmático, y muestra el ajuste general de la estructura cerrada de MscS (cintas rojas) ajustadas al mapa (cian). (Derecha) Estereovistas de secciones transversales en el mapa de densidad normal al eje séptuple en las secciones 1, 2 y 3. Las coordenadas de estructura cerrada (cintas rojas) de MscS se ajustaron al mapa usando refinamiento de cuerpo rígido en Chimera (31) que muestra la posición de las hélices transmembrana.

En estos prometedores estudios iniciales, utilizamos métodos de diálisis tradicionales para detectar las condiciones de formación de MPPN. Estos métodos consumen mucho tiempo y requieren cantidades sustanciales de una muestra. Para detectar de manera más eficiente las condiciones para la formación de MPPN con una variedad de proteínas de membrana, diseñamos y fabricamos un dispositivo de microfluidos de difusión de interfaz libre (30) (Fig.4A y Fig. S5) Este dispositivo simplifica enormemente el proceso de selección y minimiza la cantidad de muestra requerida para determinar las condiciones adecuadas para la formación de MPPN. Con este dispositivo, pudimos producir MPPN a partir de MscS pero, lo que es más importante, a partir de varias otras proteínas que anteriormente no habían logrado producir MPPN mediante la diálisis tradicional. Figura 4 B y C muestra los resultados del uso de este dispositivo para el canal mecanosensible de gran conductancia (MscL) y la conexión Cx26, respectivamente, donde los poliedros solo se observaron en presencia de la proteína diana. Curiosamente, se pudieron observar varios tamaños de partículas diferentes tanto para MscL como para Cx26 y planteamos la hipótesis de que los poliedros de tamaño variable pueden corresponder a diferentes disposiciones de empaquetamiento similares a los números de triangulación observados en conjuntos poliédricos virales. Este dispositivo de microfluidos proporcionará una detección rápida de las condiciones para la formación de MPPN y se espera que acelere el análisis estructural de proteínas de membrana en entornos de lípidos nativos.

Preparación de MPPN utilizando un sistema de difusión de interfaz libre basado en microfluidos. (A) Ilustración esquemática del dispositivo utilizado para la formación de nanopartículas de lípidos-proteínas. De izquierda a derecha, las moléculas en el flujo central se difunden hacia el flujo externo por el gradiente de concentración, con moléculas pequeñas (coeficiente de difusión más grande) moviéndose más rápidamente que las moléculas más grandes. Específicamente, los detergentes monoméricos se eliminan mediante difusión interfacial, mientras que las proteínas de membrana más grandes permanecen en el flujo central, formando nanopartículas. Tanto la relación de entrada: tampón como el caudal influyen en la formación de partículas. (B). Imágenes de microscopía electrónica de tinción negativa de MPPN de MscL y (C) Cx26 formado utilizando el dispositivo de microfluidos de A. (Barra de escala, 100 nm.) Recuadros muestran un aumento de 2,5 × de una región de interés seleccionada.

El autoensamblaje de proteínas de membrana en nanopartículas poliédricas demuestra un método potencialmente poderoso para estudiar la estructura y función de las proteínas de membrana en un entorno lipídico. Los MPPN representan una nueva forma de ensamblajes de lípidos y proteínas que se encuentran entre partículas individuales y grandes láminas o tubos cristalinos. Hemos demostrado que se pueden identificar las condiciones favorables para la formación de MPPN y hemos dilucidado la estructura, la simetría y la aplicación potencial al análisis de la estructura de la proteína de membrana. Además, hemos diseñado y fabricado dispositivos de microfluidos para la detección de alto rendimiento de las condiciones para la formación de MPPN. Los MPPN pueden permitir que se logre una variedad de perturbaciones, como pH, voltaje, osmóticos, gradientes de concentración, etc., que no se pueden lograr con otros conjuntos de proteínas de membrana y potencialmente nos permitirán activar varios tipos de canales y receptores cerrados para que la conformación activa los estados pueden investigarse estructuralmente. El potencial de tales materiales para la administración de fármacos dirigidos con mecanismos de liberación controlados con precisión ofrece una vía intrigante para futuras aplicaciones biomédicas.


9: Autoensamblaje - Lípidos, membranas - Biología

un Centro de Biofísica y Biología Cuantitativa, Universidad de Illinois en Urbana-Champaign, Urbana, IL 61801, EE. UU.
Correo electrónico: [email protected]

b Departamento de Bioquímica, Universidad de Illinois en Urbana-Champaign, Urbana, EE. UU.

c Departamento de Química, Universidad de Illinois en Urbana-Champaign, Urbana, EE. UU.

Abstracto

Muchos sistemas complejos altamente ordenados se forman por el autoensamblaje espontáneo de subunidades más simples. Una herramienta biofísica importante que se basa en el autoensamblaje es el sistema Nanodisc, que encuentra un uso extenso como entornos de tipo nativo para estudiar proteínas de membrana. Los nanodiscos se autoensamblan a partir de mezclas de fosfolípidos solubilizados con detergente y proteínas helicoidales diseñadas llamadas proteínas de andamio de membrana (MSP). La eliminación de detergente da como resultado la formación de bicapas a nanoescala estabilizadas por dos "cinturones" de MSP. A pesar de sus numerosas aplicaciones en biología y las contribuciones de muchos laboratorios en todo el mundo, se sabe poco sobre el proceso de autoensamblaje, como cuando se forma la bicapa o cuando el MSP se asocia con lípidos. Usamos espectroscopía óptica y de fluorescencia para sondar el autoensamblaje en varios equilibrios definidos por la concentración de detergente. Mostramos que la bicapa comienza a formarse por debajo de la concentración micelar crítica del detergente (10 mM), y la asociación de MSP y lípidos comienza a niveles más bajos de detergente, mostrando una dependencia de las concentraciones de MSP y lípidos. Seguir el proceso de disolución mediante la adición de detergente a nanodiscos purificados demuestra que el autoensamblaje es reversible. Nuestros datos demuestran que el autoensamblaje de Nanodisc es experimentalmente accesible y que el control de la concentración de detergente permite un control exquisito sobre la reacción de autoensamblaje. Esta mejor comprensión del autoensamblaje podría conducir a una mejor incorporación funcional de proteínas diana de membrana hasta ahora intratables.


9: Autoensamblaje - Lípidos, membranas - Biología

a GN Ramachandran Protein Center, CSIR Institute of Microbial Technology, Chandigarh, 160036, India, y B Academia de Investigación Científica e Innovadora (AcSIR), Anusandhan Bhawan, 2 Rafi Marg, Nueva Delhi, 110001, India
* Correo electrónico de correspondencia: [email protected]

Wag31, o DivIVA, es una proteína esencial y un objetivo farmacológico en el patógeno humano. Tuberculosis micobacteriana que se autoensambla en la superficie de la membrana curvada negativamente para formar un andamio estructural de orden superior, mantiene la morfología celular en forma de varilla y localiza las enzimas clave que sintetizan la pared celular en el polo para un crecimiento polar exclusivo. La estructura cristalina del dominio de unión a lípidos N-terminal de la micobacteria Wag31 se determinó a una resolución de 2,3 & # 8197 & # 197. La estructura reveló una superficie altamente polar revestida con varios residuos cargados conservados que sugieren sitios probables para interacciones con los lípidos de la membrana. El análisis de empaquetamiento de cristales reveló un estado de ensamblaje de "dímeros de dímeros" nunca antes visto de Wag31 N-terminal, que se forma mediante el apilamiento antiparalelo de dos dímeros en espiral. Los datos de dispersión de rayos X en solución de ángulo pequeño acoplados por cromatografía en columna de exclusión por tamaño revelaron una forma tetramérica como un estado de ensamblaje principal de Wag31 N-terminal en solución, lo que respalda aún más la estructura cristalina. Los resultados sugieren que, además de la unión de lípidos, el Wag31 N-terminal puede participar en el autoensamblaje para formar estructuras filamentosas. Se sugieren modelos plausibles de autoensamblaje lineal y ramificación de filamentos Wag31 consistentes con los datos disponibles.

1. Introducción

La detección de la curvatura de la membrana juega un papel fundamental en diversos procesos fisiológicos como el mantenimiento de la morfología celular, el crecimiento polar o hifal en bacterias y la endocitosis en eucariotas (Cannon et al. , 2017). Ejemplos destacados de proteínas sensibles a la curvatura positivas incluyen septinas y proteínas de dominio BAR (Bin / amphiphysin / Rvs) en eucariotas y SpoVM en bacterias esporulantes (Cannon et al. , 2017). En bacterias Gram-positivas, DivIVA reconoce la curvatura de la membrana cóncava negativa y se autoensambla en el lado citoplásmico del polo y la región curva del tabique de división celular para formar un andamio estructural (Edwards & # 38 Errington, 1997 Letek et al. , 2008 Lenarcic et al. , 2009 Ramamurthi & # 38 Losick, 2009 Kaval & # 38 Halbedel, 2012 Bach et al. , 2014). DivIVA, que es una proteína filamentosa en espiral, ayuda en la localización de varias proteínas diana en el polo para el crecimiento de la pared celular y una variedad de funciones biológicas (Rudner & # 38 Losick, 2010 Laloux & # 38 Jacobs-Wagner, 2014 Halbedel & # 38 Lewis, 2019 Hammond et al. , 2019 ).

DivIVA, también conocido como Wag31 y antígeno 84, es esencial en las micobacterias y es necesario para su crecimiento polar exclusivo, mantenimiento de la morfología y otras funciones (Nguyen et al. , 2007 Kang et al. , 2008 Mukherjee et al. , 2009 Jani et al. , 2010 Plocinski et al. , 2012 Ginda et al. , 2013 Plocinska et al. , 2014 Melzer et al. , 2018). Además, Wag31 es el objetivo de las sulfonamidas de aminopirimidina bactericidas, aunque se desconoce el mecanismo de acción antibacteriana (Boshoff, 2017 Singh et al. , 2017). Wag31 juega un papel fundamental en la regulación de la biosíntesis de peptidoglicanos y en la localización de muchas enzimas que sintetizan la pared celular en el polo para apoyar el crecimiento polar (Kang et al. , 2008 Jani et al. , 2010 Meniche et al. , 2014 Xu et al. , 2014). Wag31 está fosforado en un solo sitio (Thr73) que le permite ser mejor en la localización en el polo y en la regulación de la biosíntesis de peptidoglucanos (Kang et al. , 2008 Jani et al. , 2010). Una pequeña proteína CwsA unida a la membrana puede ayudar a la localización de Wag31 en el polo micobacteriano (Plocinski et al. , 2012). Mientras que el agotamiento de Wag31 conduce a una transición de "varilla a célula esférica" ​​(Nguyen et al. , 2007 Kang et al. , 2008 Meniche et al. , 2014), se muestra que Wag31 contribuye a la restauración de la forma de la varilla en células esféricas (Melzer et al. , 2018 ).

La oligomerización parece ser un tema recurrente en la detección de la curvatura de mesoescala (& # 8764100 & # 8197nm a 1 & # 8197 & # 181m) por subunidades de proteínas a nanoescala en varios casos (Antonny, 2011 Cannon et al. , 2017). Se sugirió un `` puente molecular de la curvatura '' por oligómeros de DivIVA como un mecanismo de unión de DivIVA a una membrana cóncava (Lenarcic et al. , 2009). Sin embargo, la forma en que DivIVA oligomeriza es poco conocida. Los datos estructurales de DivIVA se limitan hasta ahora a un solo estudio (Oliva et al. , 2010). En este estudio, un modelo de una forma tetramérica de DivIVA de 30 & # 8197nm de largo de Bacillus subtilis (bsDivIVA) se propuso sobre la base de las estructuras cristalinas de los dominios de bobina en espiral N-terminal y C-terminal individuales de DivIVA (Oliva et al. , 2010). Los pares de residuos de fenilalanina y arginina conservados en ambos extremos de esta estructura tetramérica alargada y doblada ocupan los sitios propuestos para la unión de la membrana polar (Oliva et al. , 2010). Además, la microscopía de superresolución reveló estructuras de doble anillo formadas por bsDivIVA autoensamblado cerca del tabique de división (Eswaramoorthy et al. , 2011). Micrografías de electrones que muestran la oligomerización de mutantes bsDivIVA para formar estructuras largas en forma de "hueso de perro" y cadenas y redes más largas in vitro también se informaron (Stahlberg et al. , 2004). Recientemente, se demostró que la micobacteria Wag31 (tbWag31) forma polímeros principalmente lineales de varios micrómetros de largo in vitro con curvatura o ramificación ocasional (Choukate et al. , 2019). La base estructural de estas formaciones oligoméricas sigue siendo difícil de alcanzar.

Aquí, informamos la estructura cristalina del dominio de unión a lípidos N-terminal de tbWag31 (N-Wag31) a una resolución de 2,3 & # 8197 & # 197. El análisis de empaquetamiento de cristales revela una nueva forma tetramérica de N-Wag31 compuesta por dos dominios diméricos en espiral apilados en forma antiparalela, que es compatible con la formación de filamentos lineales. Los datos de dispersión de rayos X de ángulo pequeño acoplados por cromatografía de columna de exclusión por tamaño (SEC-SAXS) que lo acompañan respaldan aún más una forma tetramérica de N-Wag31 en solución. Nuestros datos sugieren que, además de la unión de lípidos de membrana, el dominio de unión de lípidos de Wag31 puede participar en el autoensamblaje. Con base en los datos disponibles, propusimos posibles modelos de autoensamblaje de Wag31 para la formación de filamentos lineales y ramificados.

2. Materiales y métodos

2.1. Expresión de proteína recombinante

El dominio N-terminal de Wag31 (residuos 2 y # 821160 de tbWag31 con una etiqueta N-terminal que contiene residuos 'MAHHHHHHENLFYQG', el gen de codón optimizado sintetizado y subclonado en un vector pET15b por Genescript) se expresó en Escherichia coli Células BL21 (DE3). Se inició un cultivo primario de volumen 20 & # 8197 ml a 37 & # 176ºC en caldo LB que contenía 100 & # 8197 mg & # 8197 ml & # 87221 de ampicilina y se incubó durante la noche. Este cultivo primario se transfirió y se hizo crecer en 2 & # 8197l de caldo LB a 37 & # 176C hasta una DO. 600 de 0,6 se alcanzó. A continuación, se indujo la expresión de proteína recombinante añadiendo 1 & # 8197m METRO Se incubaron las células y el IPTG a 25 ° C 176 ° C durante 16 ° C 8197 h. Las células se recolectaron y almacenaron a & # 872280 & # 176ºC para uso adicional.

2.2. Purificación de proteínas

Los sedimentos celulares congelados se resuspendieron en tampón de lisis que contenía 20 & # 8197 m METRO Tris-HCl pH 7.0 y 150 & # 8197m METRO NaCl con Triton-X 100 al 0,2% y luego se lisó mediante sonicación. El lisado celular se cargó en una columna de afinidad de flujo rápido IMAC Sepharose de níquel (GE healthcare) y la proteína unida se eluyó con un tampón que contenía 50 & # 8197m METRO Tris y # 8211HCl a pH 7.0, 150 y # 8197m METRO NaCl y 500 & # 8197m METRO imidazol. Las fracciones de interés se agruparon, concentraron y purificaron adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño utilizando una columna HiLoad 16/60 Superdex de 200 pg (GE healthcare) en el siguiente tampón: 50 & # 8197m METRO Tris & # 8211HCl a pH 7.0 y 150 & # 8197m METRO NaCl.La proteína N-Wag31 recién purificada se concentró a 10 & # 8197 mg & # 8197 ml & # 87221 para experimentos de cristalización.

2.3. Espectropolarimetría de dicroísmo circular

Para la estimación de la estructura secundaria, se midieron los espectros de CD de N-Wag31 purificado a una concentración de & # 87641 & # 8197 mg & # 8197 ml & # 87221 a 25 & # 176ºC usando un espectropolarímetro Jasco J815 interno. Se promediaron tres barridos de espectros de CD y se representaron como elipticidad del residuo molar frente a la longitud de onda.

2.4. Cristalización y recopilación de datos

Los cristales de N-Wag31 se cultivaron mediante métodos de difusión de vapor de gota colgante y caída a 19 ° C en 0,2 ° C y ° 8197. METRO cloruro de magnesio, 0.1 & # 8197 METRO cacodilato de sodio a pH 6,5 y 50% ( v / v ) polietilén glicol 200. Estos cristales eran muy pequeños y recalcitrantes al crecimiento. Los cristales se congelaron instantáneamente en nitro & # 173gen líquido sin ningún crioprotector adicional y se transportaron a la Instalación Europea de Radiación Sincrotrón (ESRF) en Francia. Los datos de difracción de rayos X de un cristal N-Wag31 se recogieron en la línea de luz de microfoco ID30A-3 (MASSIF-3) en ESRF, que es adecuada para cristales tan pequeños. Solo se obtuvo un conjunto de datos útiles después de probar 37 cristales. La recogida de datos se llevó a cabo a 100 & # 8197K, usando un detector EIGER (DECTRIS Ltd). La indexación, el procesamiento, la fusión y el escalado de datos se realizaron utilizando XDS (Kabsch, 2010) y el PCCh 4 suite de software (Winn et al. , 2011 ).

2.5. Determinación de la estructura cristalina, construcción de modelos y refinamiento.

La estructura cristalina de N-Wag31 se determinó mediante el método de reemplazo molecular ( MOLREP , Vagin & # 38 Teplyakov, 1997). La estructura cristalina de su homólogo N-bsDivIVA (código PDB 2wuj Oliva et al. , 2010) se utilizó como modelo de búsqueda en forma dimérica, luego de convertirlo en un modelo de polialanina. Tras la minimización del cuerpo rígido de la mejor solución, se realizaron refinamientos posicionales utilizando REFMAC (Murshudov et al. , 1997) con restricciones de simetría no cristalográfica (NCS). Un R gratis conjunto se utilizó para monitorear el progreso del refinamiento y el isotrópico individual B Los factores fueron refinados. La reconstrucción del modelo se realizó utilizando Focha (Emsley et al. , 2010 ). SIGMAA Se utilizaron mapas de diferencias ponderadas y mapas OMIT compuestos para la reconstrucción del modelo. En las últimas etapas de refinamiento, se realizaron corridas de recocido simulado en Fénix (Adams et al. , 2010). Las restricciones NCS también se liberaron durante las rondas finales del refinamiento. Además de dos cadenas de proteínas y moléculas de agua, la unidad asimétrica contiene la mitad de un tri & # 173etil & # 173en glicol (PGE) relacionado consigo mismo mediante una operación de simetría cristalográfica doble. MOLPROBIDAD se utilizó para la validación de la estructura (Chen et al. , 2010 ).

N-Wag31 contiene dos cadenas, A y B, en la unidad asimétrica [Figs. 1 ( a ) y S1 en la información de apoyo]. Además de los residuos 2 y # 821160, la cadena A contiene un segmento grande y contiguo de la región de etiqueta de poli-histidina (residuos & # 87229 a 1). La cadena B contiene los residuos 2 y # 821160. Un tripéptido aislado que interactúa con una molécula vecina, que contiene tentativamente la secuencia "HHE", se asignó a la cadena B. Sin embargo, como este segmento de tripéptido está lejos del resto de la cadena B, no se puede descartar un error fuera de registro. La densidad de electrones en y alrededor de la región del bucle que contiene los residuos 17 & # 821120 fue bastante pobre, especialmente en la cadena A. La conformación de la cadena principal para esta región del bucle se trazó y construyó en el mapa de densidad de electrones para la cadena B y se reconstruyó de la misma manera para la cadena A. Las densidades de la cadena lateral fueron malas para varios residuos alrededor de esta región del bucle y en el extremo C-terminal de N-Wag31, lo que se refleja en factores de temperatura superiores a la media para estas cadenas laterales. Todas estas cadenas laterales se modelaron utilizando rotámeros adecuados de la Focha biblioteca rotamer (Lovell et al. , 2000). La pérdida de densidad de la cadena lateral podría ser el resultado del daño por radiación causado por los rayos X en la línea de luz del microfoco o la flexibilidad. Las estadísticas de recopilación y refinamiento de datos se resumen en la Tabla 1. Las figuras se prepararon utilizando PyMOL ( El sistema de gráficos moleculares PyMOL , Schrodinger, LLC) y CCP4MG desde el PCCh 4 suite (Winn et al. , 2011 ).

tabla 1
Estadísticas de difracción de cristal y refinamiento del modelo (generadas usando la opción Tabla 1 de Fénix Adams et al. , 2010 )

Las estadísticas del shell de mayor resolución se muestran entre paréntesis.


Figura 1
Estructura cristalina de N-Wag31. ( a ) Se muestran dos vistas casi ortogonales del dímero N-Wag31 (residuos 2 & # 821160) como cintas azul y marrón pálido. Los ejes de bobinas en espiral locales calculados se muestran como líneas rojas unidas. ( B ) Un perfil de CD (elipticidad de residuo molar frente a longitud de onda) de N-Wag31. ( C ) Se muestran las estructuras superpuestas de N-Wag31 (azul) y N-bsDivIVA (coral). ( D ) La región de bucle entrelazado en N-Wag31 (azul) que contiene el P 16 PAG 17 I 18 secuencia (bolas y palos, con átomos de carbono en azul claro, oxígeno en rojo y nitro & # 173gen en azul) y la región equivalente en N-bsDivIVA (coral) que contiene los residuos Phe17 apilados (bolas y palos, con átomos de carbono en coral, oxígeno en rojo y nitro & # 173gen en azul). ( mi ) Se muestra la alineación de secuencia múltiple de la región N-terminal de tbWag31 (numeración para tbWag31 en rojo) y homólogos, con el grado de conservación (preparado en Jalview Waterhouse et al. , 2009 ).

2.6. Cromatografía de exclusión por tamaño junto con el experimento SAXS

Los experimentos SEC-SAXS se realizaron en la línea de luz BM29 en ESRF usando un sistema de HPLC Shimadzu. El N-Wag31 purificado (4.4 & # 8197 mg & # 8197ml & # 87221) en un tampón que contiene 20 & # 8197m METRO Tris pH 7.5, 150 y # 8197m METRO Se utilizó NaCl y glicerol al 10% para los experimentos de SAXS. La proteína se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se transportó al sitio del sincrotrón, donde se descongeló en hielo antes de los experimentos. Además, se inyectaron 30 & # 8197 & # 181l de muestra de proteína en una columna Agilent Bio-SEC-3. Los datos de SEC-SAXS se recopilaron a una longitud de onda de rayos X & # 87641 & # 8197 & # 197, con una exposición de 1 & # 8197s & # 8197frame & # 87221 y una distancia del detector de 2,8 & # 8197m, utilizando un detector Pilatus (Dectris Ltd). El análisis de datos SEC-SAXS se realizó utilizando el ATSAS suite de software (Franke et al. , 2017 ).

2.7. Disponibilidad de datos

Las coordenadas de la estructura de la proteína y los factores de estructura se han depositado en el AP con el código de acceso 6lfa. Los datos SAXS para el pico II están disponibles en SASBDB con el código de acceso SASDHH4.

3. Resultados

3.1. Estructura cristalina del dominio N-terminal de Wag31

La micobacteria Wag31 (P9WMU1, Rv2145c) es una proteína formadora de filamentos largos de 260 residuos que contiene dos dominios: un dominio de unión a lípidos o membrana N-terminal y un dominio C-terminal que participa en la localización de proteínas polares. La estructura cristalina del dominio N-terminal de tbWag31, o N-Wag31, muestra un dímero en espiral paralelo compuesto por dos cadenas, A y B, que contienen los residuos 2 & # 821160 y residuos adicionales de las regiones de etiqueta de poli-histidina [Fig. . 1 ( a ), consulte la Fig. & # 8197S1 y la sección de métodos experimentales]. Las dos cadenas de N-Wag31 son similares entre sí, con una desviación cuadrática media (RMSD) de 0.65 & # 8197 & # 197 para 59 C & # 945 átomos (calculada usando HACER CLIC Nguyen et al. , 2011). El segmento N-terminal de N-Wag31 contiene un giro helicoidal corto (hélice H1) y un bucle seguido de un giro brusco que une la hélice de bobina enrollada (hélice H2). La región del bucle está entrelazada en el dímero N-Wag31, como se observa para los dominios N-terminales de sus homólogos estructurales bsDivIVA (N-bsDivIVA) y GpsB (Oliva et al. , 2010 Halbedel y # 38 Lewis, 2019 Cleverley et al. , 2019). Los datos de CD obtenidos de N-Wag31 apoyaron una estructura de N-Wag31 rica en hélice & # 945 en solución, con un contenido helicoidal estimado de & # 876460% [Fig. 1 ( B ), calculado utilizando K2D Andrade et al. , 1993]. El paso promedio de la bobina enrollada es & # 8764171 & # 8197 & # 197 para los residuos 26 & # 821160 de N-Wag31 (calculado usando TORNADO Strelkov y # 38 Burkhard, 2002).

La estructura de N-Wag31 es similar a la estructura de su homólogo N-bsDivIVA, con el que comparte & # 876442% de identidad de secuencia, con 1,6 & # 8197 & # 197 RMSD para 56 & # 8197C & # 945 átomos en una cadena [Fig. . 1 ( C ), calculado usando Dali (Holm, 2019)]. Sin embargo, las dos estructuras difieren significativamente en la región del bucle entrelazado que alberga el sitio de unión a lípidos [Figs. 1 ( C ) y 1 ( D )]. En la estructura de N-bsDivIVA, se demostró que dos residuos de fenilalanina espacialmente adyacentes (Phe17) de los bucles entrelazados de dos subunidades en el dímero en espiral participaban en la unión de lípidos [Fig. 1 ( D ) Oliva et al. , 2010 Halbedel y # 38 Lewis, 2019]. La supuesta región de unión a lípidos en N-Wag31 alberga una `P 16 PAG 17 I 18 'motivo en lugar de Phe17 [Figs. 1 ( D ) y 1 ( mi )]. La Ile18 no polar expuesta en la punta del bucle entrelazado es un candidato para la interacción directa con el lípido de la membrana. Sin embargo, las distancias entre los átomos de C & # 945 de los dos residuos Ile18 en N-Wag31 son & # 876415 & # 8197 & # 197. En comparación, los átomos de C & # 945 de los residuos de Phe17 que se unen a lípidos en N-bsDivIVA están separados por & # 87645 & # 8197 & # 197, con sus anillos aromáticos de cadena lateral apilados [Fig. 1 ( D )]. Un cambio conformacional puede posiblemente unir las cadenas laterales hidro & # 173fobias de Ile18 juntas en N-Wag31 para formar un parche de interacción con lípidos. Por otro lado, la presencia de dos residuos de prolina antes de Ile18 hace que esta región sea estructuralmente rígida. Por tanto, la supuesta región de unión a lípidos es bastante diferente en N-Wag31 que en N-bsDivIVA.

3.2. El análisis de empaquetamiento de cristales sugiere una organización de "dímeros de dímeros" de N-Wag31

Las bobinas enrolladas se pueden ensamblar de varias maneras para formar ensamblajes de orden superior (Moutevelis & # 38 Woolfson, 2009). Para aprender sobre el ensamblaje de N-Wag31, realizamos un análisis de empaquetamiento de cristales. Parece que el dominio dimérico en espiral de N-Wag31 se combina con un dímero relacionado con doble simetría cristalográfica adyacente para formar un tetrámero [Figs. 2 ( a ) y 2 ( B )]. La interfaz isóloga en N-Wag31 se asignó mediante el PDBePISA servidor (Krissinel & # 38 Henrick, 2007). El tetrámero entierra & # 8764396.0 & # 8197 & # 197 2 de área de superficie accesible al agua después del ensamblaje, con la bobina enrollada formando hélices H2 de las dos cadenas B con formas de superficie complementarias apiladas entre sí [Figs. 2 ( C ) y 2 ( D )]. Las dos hélices H2 apiladas están en orientación casi antiparalela, con un ángulo de & # 8764176 & # 176 entre los dos ejes de la hélice local (calculado utilizando los residuos 26 & # 821141).


Figura 2
Organización oligomérica de N-Wag31. ( a ), ( B ) Dos vistas de la forma "dímero de dímeros" de N-Wag31 relacionadas por simetría cristalográfica doble se muestran como cintas (arco iris de Jones, azul a rojo). La bobina en espiral que forma hélices H2 en las cadenas A y B en ambos dímeros se etiquetan de la siguiente manera: H2A1 y H2B1 en las cadenas A y B del dímero 1, y H2A2 y H2B2 en las cadenas A y B del dímero 2. Las direcciones de la Los dominios C-terminales (Ct) están marcados con flechas rojas en ( a ). El doble eje de rotación se muestra como una varilla roja en ( a ). Una molécula de PGE unida a N-Wag31 se muestra como palos en ( B ). ( C ), ( D ) Dos vistas del "dímero de dímeros" de N-Wag31 se muestran como cintas (cian) dentro de la superficie molecular semitransparente (gris) del tetrámero. Las cadenas laterales de los residuos que forman la interfaz se muestran como bolas y palos (carbono en magenta, oxígeno en rojo y nitro & # 173gen en azul). En el recuadro se muestra una vista ampliada de los residuos de la cadena lateral (Arg41, Glu27, Leu34, Ala30 y Glu38) en la interfaz.

El tamaño del área de superficie enterrada es una cantidad crítica que ayuda a distinguir entre contactos de cristal e interfaces biológicas (& # 8764370 & # 82114750 & # 8197 & # 197 2 para un homodímero Henrick & # 38 Thornton, 1998 Krissinel & # 38 Henrick, 2007) . El área de la superficie enterrada en la interfaz cristalográfica relacionada con el doble en N-Wag31 es pequeña (& # 8764396.0 & # 8197 & # 197 2). Esta interfaz cristalográfica está revestida por residuos que se conservan en muchas actinobacterias, como Asp26, Glu27, Ala30, Leu34 y Arg41 [Fig. 2 ( C )]. El centro de esta interfaz está formado por Leu34 y Ala30 no polares enterrados. Se forman dos puentes salinos entre las cadenas laterales de los residuos Glu27 y Arg41 en esta interfaz en ambos lados de la región central no polar [Fig. 2 ( C )]. Se detectó una segunda área de superficie enterrada (& # 60300 & # 8197 & # 197 2) en el extremo C-terminal de N-Wag31, que probablemente se forma debido al empaquetamiento de cristales. Además, se encontró una molécula de PEG enterrada en un lado de esta interfaz de ensamblaje, cubriendo una parte bastante pequeña, & # 876480 & # 8197 & # 197 2, del área de superficie accesible de la hélice N-terminal H1 [Fig. & # 81972 ( B )]. Tenga en cuenta que la formación de una forma tetramérica de N-Wag31 en ausencia de PEG está respaldada por los datos de SAXS en solución, que se describen en la siguiente sección.

3.3. La dispersión de la solución admite una organización de "dímeros de dímeros" de N-Wag31

Para determinar los estados de ensamblaje de la solución de N-Wag31, realizamos un experimento SEC-SAXS. El perfil de elución de la columna de exclusión por tamaño de N-Wag31 reveló la presencia de múltiples estados de ensamblaje eluidos como picos separados, numerados de izquierda a derecha como picos I, II y III, respectivamente [Figs. 3 ( a ) y S2 ( a )]. El pico de elución inicial I sugiere la presencia de grandes agregados [Figs. 3 ( a ) y S2 ( B )]. Los datos SAXS promediados obtenidos del pico III, que esperamos sea un dímero, fueron demasiado débiles para el análisis. El análisis de datos SAXS sugiere que la región del pico II contiene una forma tetramérica de N-Wag31 (& # 87648.6 & # 8197kDa & # 8197monomer & # 87221), con una masa predicha de & # 876434.6 & # 8197kDa basada en el método de inferencia bayesiano (Hajizadeh et al. , 2018). El pico central II parece ser el estado de ensamblaje principal en solución [Fig. S2 ( a )]. Se usaron residuos & # 87229 a 1 de la cadena A de N-Wag31 que contenían una etiqueta de poli-histidina casi completa para construir una región equivalente de la cadena B del dímero y el tetrámero, usando operaciones NCS, para todos los cálculos de SAXS. Sin embargo, esta región de etiqueta podría tener una solución flexible. El radio de giro ( R gramo ) obtenido del análisis Guinier de datos SAXS promediados del pico II fue 27.2 & # 8197 & # 197 [ q R gramo & # 8804 1.3, Figura 3 ( a ), dónde q se refiere a la transferencia de impulso en nm & # 87221], mientras que R gramo calculado a partir de coordenadas diméricas / tetraméricas N-Wag31 fue & # 876420,9 y 24,2 & # 8197 & # 197, respectivamente. & # 967 2 valores para los ajustes entre las intensidades de dispersión teóricas derivadas de los modelos tetramérico y dimérico N-Wag31 con la intensidad de dispersión promediada experimental del pico II fueron 1,45 y 4,0, respectivamente, apoyando aún más la estructura tetramérica [Fig. 3 ( B )]. Como los datos SAXS promediados eran bastante ruidosos en la región de ángulo alto e inadecuados para un análisis posterior, no se realizaron reconstrucciones de formas. En resumen, los datos de la solución SEC-SAXS admiten un ensamblaje tetramérico de N-Wag31, que es consistente con la estructura cristalina.


figura 3
Análisis de datos SEC-SAXS. ( a ) Un perfil de elución SAXS (intensidad media frente al número de fotogramas obtenido de CROMIXS Franke et al. , 2017) de N-Wag31. La trama de Guinier [ln I ( q ) versus q 2 , I es intensidad y q es la transferencia de momento en nm & # 87221] para el pico II se muestra en el recuadro. ( B ) Un perfil de dispersión de los datos del pico II ( I versus q en & # 197 & # 87221). Perfiles de dispersión calculados de N-Wag31 dimérico y tetramérico (calculados utilizando CRYSOL con los parámetros sugeridos Franke et al. , 2017) se muestran ajustados a los datos experimentales.

3.4. La distribución de la carga superficial sugiere sitios putativos de unión a lípidos en N-Wag31

El mapeo del potencial electrostático de Poisson & # 8211Boltzmann en la superficie accesible al solvente reveló que la superficie del dímero N-Wag31 de unión a lípidos es altamente polar [Figs. 4 ( a )𔃂 ( C )]. La secuencia N-Wag31 contiene 14 residuos cargados negativamente y seis residuos cargados positivamente. La superficie del homólogo N-bsDivIVA, con varios residuos cargados, es igualmente polar (Oliva et al. , 2010). Esto no es sorprendente ya que los aminoácidos cargados son más comunes en las bobinas enrolladas que otras proteínas (Surkont & # 38 Pereira-Leal, 2015). El cálculo del potencial electrostático muestra un parche cargado positivamente en la región del bucle entrelazado de N-Wag31, que está revestido con residuos conservados de arginina y lisina [Figs. 4 ( a ) y 4 ( B )]. Esta región probablemente define la superficie de asociación de membrana cargada positivamente conservada en la familia de proteínas Wag31 / DivIVA y GpsB que interactúan con los lípidos fosfo & # 173 de membrana (Oliva et al. , 2010 Killian & # 38 Heijne, 2000 Halbedel & # 38 Lewis, 2019).


Figura 4
Distribución de carga superficial en N-Wag31. ( a )–( C ) Se muestran diferentes vistas del dimérico N-Wag31 (gris) con el potencial electrostático mapeado en la superficie semitransparente accesible al agua (un radio de agua de 1,4 & # 8197 & # 197). Los residuos conservados con carga positiva (Lys15, Lys20, Arg21) en la región del bucle entrelazado que interactúa con los lípidos de N-Wag31 se muestran como bolas y palos azules en ( a ). El potencial electrostático se calculó utilizando APBS con ÁMBAR cargos y parámetros predeterminados (Baker et al. , 2001 ).

Además de la región de bucle entrelazado cargada positivamente, la forma tetramérica de N-Wag31 contiene parches cargados negativamente en su superficie accesible al agua [Figs. 4 ( a )𔃂 ( C )]. Los residuos de proteína cargados negativamente pueden interactuar con los lípidos de etano y # 173lamina en la membrana (Jur & # 225sek et al. , 2019). El etano & # 173lamina está presente en la membrana micobacteriana (Chiaradia et al. , 2017) y potencialmente puede interactuar con parches de superficie cargados negativamente conservados en el tetramérico N-Wag31.

3.5. Un modelo sugerido para la formación de filamentos Wag31

Recientemente se informó de filamentos lineales, con ramificación esporádica, para tbWag31 de longitud completa (Choukate et al. , 2019).Los diámetros promedio de estos filamentos tbWag31 de longitud completa (1.4 & # 82112.1 & # 8197nm, Choukate et al. , 2019) son aproximadamente similares al diámetro de una bobina enrollada, que es & # 87642 & # 8197nm. El N-Wag31 forma un "dímero de dímeros" con las regiones C-terminales que se extienden en direcciones opuestas, lo que es compatible con dicha formación de filamentos lineales [Fig. 2 ( a )]. Se puede disponer una subunidad de proteína para formar un filamento de varias formas [Figs. 5 ( a ) y 5 ( B )]. Podría polimerizar mediante una repetición de traslación pura a lo largo de una determinada dirección o podría polimerizar mediante una combinación de rotación y traslación a lo largo de un eje helicoidal. Alternativamente, una subunidad de proteína puede formar un filamento utilizando operaciones de simetría doble. Para una proteína con un dominio N-terminal N y un dominio C-terminal C, dos de tales arreglos teóricos serían & # 8212NC & # 8212NC & # 8212NC & # 8212NC & # 8212NC & # 8212 o & # 8212NC & # 8212CN & # 8212NC & # 8212CN & # 8212NC & # 8212 [Figs. 5 ( a ) y 5 ( B )]. En el último caso, se formarían interfaces entre subunidades N & # 8212N y C & # 8212C relacionadas por doble simetría [Fig. 5 ( B )]. Wag31 parece formar un filamento lineal utilizando la segunda opción que implica operaciones de simetría doble [Fig. 5 ( C )].


Figura 5
Un modelo propuesto de ensamblaje de filamentos Wag31. ( a ), ( B ) Dos posibles modos teóricamente alternativos de autoensamblaje de Wag31, utilizando ( a ) operaciones de repetición traslacional pura y ( B ) se muestran las operaciones de repetición relacionadas con la simetría doble. ( C ) Diagramas de cinta de los tetrámeros de N-terminal N-Wag31 (azul, este trabajo) y el dominio C-terminal de bsDivIVA (rojo, Oliva et al. , 2010), unidas por regiones enlazadoras como líneas discontinuas, como un filamento teórico. La región enlazadora tiene una longitud de residuos de & # 876420 en bsDivIVA, y de residuos de & # 8764100 en tbWag31. ( D ), ( mi ) Dos vistas de un hexámero teórico compuesto por tres dímeros de N-Wag31 (cintas en verde, azul y magenta). Los dos ejes de rotación se muestran como barras rojas. ( F ) Un modo teóricamente posible de ramificación de 3 vías en el filamento tbWag31.

La estructura del dominio C-terminal de tbWag31, que se prevé que sea una bobina enrollada (Choukate et al. , 2019), actualmente no está disponible. Se demostró que un modelo de baja resolución del dominio C-terminal de bsDivIVA forma un "dímero de dímeros", con una región central del haz de 4 hélices [Fig. 5 ( C ) Oliva et al. , 2010]. La identidad de secuencia entre este dominio C-terminal truncado de bsDivIVA y el de la región C-terminal de tbWag31 (residuos 165 & # 8211234) es de aproximadamente 26%, lo que sugiere que el C-terminal Wag31 puede asumir un `dímero de bsDivIVA similar a -estructura de los dímeros. Se puede utilizar una combinación de estos dos "dímeros de dímeros" N-terminales y C-terminales para construir un filamento lineal de Wag31 [Fig. 5 ( C )].

Además, la ubicación de la interfaz relacionada con la simetría doble en el N-Wag31 sugiere una forma natural de asociación lateral o lateral de unidades N-Wag31 diméricas para formar oligómeros de orden superior, como un hexámero [Figs. 5 ( D )𔃃 ( F )]. Tal asociación hexámera teórica de N-Wag31 puede conducir a ramificaciones o bifurcaciones en un filamento Wag31 (entre otras posibilidades), y puede aprovecharse para el diseño de andamios basados ​​en proteínas [Figs. 5 ( D ) y 5 ( mi )].

4. Conclusiones

La estructura cristalina de N-Wag31 informada aquí revela una forma tetramérica de N-Wag31, que está respaldada además por los datos de la solución SAXS. Por el contrario, se informa que el N-bsDivIVA homólogo es un dímero en solución (Oliva et al. , 2010). Se construyó una forma tetramérica de bsDivIVA combinando las estructuras cristalinas de los `dímeros de dímeros 'C-terminales y dos dominios N-terminales diméricos ubicados terminalmente (Oliva et al. , 2010). Sin embargo, no era obvio cómo un tetrámero de este tipo se puede ensamblar para construir estructuras de orden superior. Basado en micrografías electrónicas de filamentos formados por mutantes bsDivIVA, se sugirió una vía de ensamblaje de bloques de construcción básicos en forma de `` hueso de perro '' (Stahlberg et al. , 2004). Sin embargo, los detalles atómicos de tal ensamblaje seguían siendo esquivos. La forma tetramérica de N-Wag31 descrita aquí aclara la base estructural de tal formación de ensamblaje que involucra el dominio de unión a lípidos N-terminal que puede conducir a estructuras de orden superior. Además, considerando que tbWag31 es un objetivo farmacológico de alta confianza (Singh et al. , 2017 Boshoff, 2017), los datos estructurales presentados aquí se pueden aprovechar para diseñar inhibidores.

Actualmente se desconoce cómo se orienta el N-Wag31 en la superficie de la membrana polar para la detección de curvatura. Los estudios de simulación de dinámica molecular sugirieron que la composición de lípidos puede influir en la orientación de DivIVA en la membrana (Jur & # 225sek et al. , 2019). Los lípidos de etano y # 173lamina pueden interactuar con parches de superficie cargados negativamente, lo que hace que DivIVA se vuelva a alinear de la orientación perpendicular a la paralela en la superficie de la membrana (Jur & # 225sek et al. , 2019). Asimismo, la orientación de N-Wag31 puede determinarse mediante interacciones que implican tanto la región de bucle entrelazado cargada positivamente como parches superficiales cargados negativamente [Figs. 4 ( a )𔃂 ( C )] con los lípidos de la membrana polar.

La estructura cristalina de N-Wag31 que comprende los residuos 2 & # 821160 de tbWag31 plantea preguntas sobre el posible papel estructural del residuo Thr73 fosfo & # 173rilado. El residuo Thr73 está en una supuesta región intrínsecamente no estructurada adyacente al dominio N-terminal de Wag31 (Choukate et al. , 2019) y proximal a varios residuos de glicina, como G 63 GRAMO 64 GRAMO 65 X 66 GRAMO 67 [Higo. 1 ( mi )]. Los residuos de glicina pequeños y que imparten flexibilidad son típicamente raros en bobinas enrolladas (Surkont & # 38 Pereira-Leal, 2015). Dentro de la repetición de la heptada clásica ' abcdefg 'en una bobina enrollada, el' a 'y' D 'regiones están enterradas en el interior donde' gramo 'y' mi Las regiones 'hacen interacciones iónicas entre las hélices para estabilizar el conjunto de la bobina enrollada. Si la asignación de heptada en espiral (realizada por TORNADO Strelkov & # 38 Burkhard, 2002) se extiende teóricamente más allá del último residuo (Leu60, asignado ` a ') observado en la estructura cristalina, el residuo 73 estará en el' gramo 'posición asumiendo la continuidad de la bobina en espiral, y podría ser crítica para proporcionar un enlace salino estabilizador para la continuación de la bobina en espiral en la forma fosforilada de tbWag31 en una región por lo demás flexible.

Información de soporte

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. Nishant Varshney y al personal de las líneas de luz BM29 e ID30 en ESRF por su ayuda durante la recopilación de datos. También agradecemos al profesor Jan L & # 246we de MRC, Cambridge, por proporcionar las coordenadas del dominio C-terminal de bsDivIVA.

Información de financiación

Los autores desean agradecer a CSIR por el apoyo y la beca de investigación intramuros a KC. También agradecemos al Departamento de Biotecnología (DBT), al Gobierno de la India y al programa de acceso ESRF-DBT administrado por el Centro Regional de Biotecnología, Faridabad, por apoyar la difracción de rayos X y la recopilación de datos SEC-SAXS en ESRF, Francia.

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9: Autoensamblaje - Lípidos, membranas - Biología

a Departamento de Química, Imperial College London, South Kensington Campus, Londres SW7 2AZ, Inglaterra
* Correo electrónico de correspondencia: [email protected]

Las membranas se encuentran entre las estructuras biológicas más importantes, mantienen la integridad fundamental de las células, compartimentan regiones dentro de ellas y desempeñan un papel activo en una amplia gama de procesos celulares. La presión puede desempeñar un papel clave al sondear la estructura y la dinámica de los conjuntos de membranas, y también es fundamental para la biología y la adaptación de los organismos de aguas profundas. Este artículo presenta una descripción general del efecto de la presión sobre la mesoestructura de las membranas lipídicas, la organización bicapa y los conjuntos de lípidos y proteínas. También resume los desarrollos recientes en instrumentación estructural de alta presión adecuada para experimentos con membranas.

1. Introducción

Más del 70% de la Tierra está cubierta de agua, a una profundidad promedio de 3.8 & # 8197km, que ejerce una presión de casi 40 & # 8197MPa (400 & # 8197bar). A pesar de presiones tan altas, la vida prospera en el océano. De hecho, durante los últimos 30 años, se han descubierto organismos adaptados a la presión en condiciones oceánicas cada vez más extremas. El fondo de la Fosa de las Marianas alcanza los 11 & # 8197 km por debajo del nivel del mar, ejerciendo una presión superior a 100 & # 8197MPa (1 & # 8197kbar) (Picard & # 38 Daniel, 2013), e incluso a estas presiones se han encontrado bacterias adaptadas. Estos organismos deben tener mecanismos para adaptar sus membranas lipídicas para mantener su estructura fundamental y propiedades mecánicas (Bartlett, 2002). Si bien la adaptación a altas presiones es un fenómeno bien establecido (Meersman & # 38 McMillan, 2014 Casadei et al. , 2002), los mecanismos regulatorios empleados son poco conocidos y son objeto de gran interés.

Además de su relevancia directa para la biología de los organismos de aguas profundas, la alta presión puede desempeñar un papel clave en el estudio de la estructura y dinámica de los conjuntos biológicos. La presión hidrostática se puede utilizar para impulsar cambios estructurales en bio & # 173 & # 173 & # 173mol & # 173éculas, y ofrece ventajas significativas sobre otros factores desencadenantes de cambio de estructura, como cambios de temperatura y composición, tanto en el equilibrio como durante cambios rápidos: la alta presión no tiende a interrumpir La unión intramolecular por debajo de 2 & # 8197GPa de presión se puede aplicar y liberar de una muestra de manera extremadamente rápida con presión tanto en aumento como en disminución y, debido a la rápida propagación de la presión, se equilibra rápidamente en toda la muestra. Muchos cambios estructurales en los conjuntos de membranas tienen lugar en la escala de tiempo de milisegundos a segundos y, por lo tanto, mediante el uso de saltos de presión rápidos, la variable de activación termodinámica se puede desacoplar del cambio estructural, lo que permite estudiar la cinética en tiempo real y la evolución de estos cambios utilizando Técnicas de sonda rápida.

Esta revisión ofrece una descripción general de los avances recientes en las investigaciones estructurales de alta presión de conjuntos de membranas modelo y de algunos de los desarrollos tecnológicos recientes que han respaldado estos experimentos.

2. Efecto de la presión sobre los conjuntos de membranas

Las membranas se encuentran entre las más importantes de todas las estructuras biológicas. Además de mantener la integridad y compartimentación básica de las células, se sabe que los lípidos desempeñan un papel vital en la señalización celular, y cada vez hay más evidencia de que la micromecánica de las membranas ayuda a modular la actividad de las proteínas, péptidos, canales y receptores incrustados en ellas ( van den Brink-van der Laan et al. , 2004 ).

El papel estructural de las membranas lipídicas en biología se sustenta en el hecho de que los lípidos son moléculas anfifílicas y, por lo tanto, pueden autoensamblarse. Los lípidos forman una variedad de fases cristalinas líquidas liotrópicas tipo I (normal) y tipo II (inversa) cuando se mezclan con agua (Seddon, 1990) (Fig. 1). Estos incluyen el fluido laminar (L α ), hexagonal bidimensional (H I / H II ) y fases cúbicas bicontinuas inversas (Q II G, Q II D, Q II P), y fases micelares ordenadas (incluyendo una serie de estructuras micelares inversas ordenadas novedosas recientemente descubiertas) (Shearman et al. , 2009 Perroni y # 38 Mahanthappa, 2013). La estructura adoptada por un conjunto de lípidos hidratados depende en gran medida de la curvatura preferida de los lípidos, así como de efectos más sutiles, como la interacción entre la curvatura, la tensión elástica y la frustración del empaquetamiento de la cadena (Shearman et al. , 2006). Todos estos factores pueden verse afectados por la presión (Seddon et al. , 2006 ).


Figura 1
Ejemplos de estructuras de cristal líquido liotrópico lipídico autoensambladas. ( a ) Laminar (L α ), ( B ) giroide cúbico bicontinuo inverso inverso (Q II G) (se muestra una bicapa sobre la superficie mínima) y ( C ) hexagonal inverso (H II ).

2.1. Curvatura de la membrana

El efecto de la presión sobre cualquier estructura es impulsar una reducción en el volumen (Royer, 1995) y, en los conjuntos de lípidos, el resultado neto del aumento de la presión es una reducción en el movimiento de la cadena de hidrocarburos y un aumento correspondiente en el orden de la cadena (Skanes et al. , 2006). Estos efectos tenderán a reducir el área de la sección transversal de las colas de hidrocarburos lipídicos. Es importante destacar que el área de la sección transversal de los grupos de cabeza lipídica es significativamente menos sensible a la presión y, por lo tanto, el aumento de la presión tenderá a aumentar la curvatura espontánea de una monocapa lipídica (alejando la curvatura del entorno acuoso). Cabe señalar que, para los sistemas de tipo II (curvatura inversa), el aumento de la presión provocará una reducción en la magnitud de la curvatura negativa preferida (Shearman et al. , 2006 ).

Los aumentos moderados de presión tenderán a incrementar el parámetro de red de las mesofases de lípidos fluidos tipo 0 (plano) y tipo II (inverso) en contacto con el exceso de agua. Hay dos contribuciones distintas a este efecto. En primer lugar, el orden en cadena tenderá a conducir a un aumento en el parámetro de red, como se muestra en la Fig. 2, aunque esto puede compensarse parcialmente por la compresión isotrópica del agua que se incorpora a la mesofase. En segundo lugar, para las estructuras inversas, el aumento de la presión provocará una reducción en el área de la sección transversal de la cadena, lo que tenderá a reducir la magnitud de la curvatura negativa, lo que conducirá a un aumento significativo en el parámetro de celosía (Fig. 3). Este mecanismo de hinchamiento se basa en que hay un exceso de agua disponible para fluir hacia los canales de agua hinchados y no se observa en condiciones de hidratación limitadas (Tang et al. , 2012). La inversa H hexagonal II La estructura se forma a partir de un empaquetamiento hexagonal de micelas inversas cilíndricas, lo que conduce a la frustración del empaquetamiento de la cadena (Fig. 3), donde las cadenas lipídicas deben adoptar diferentes conformaciones en diferentes partes de la estructura. El costo de energía de esta frustración de empaquetamiento aumenta con parámetros de celosía más grandes y, por lo tanto, limita el hinchamiento inducido por la presión en H II fases, aunque todavía tienden a hincharse un poco más que las fases laminares. Las fases cúbicas bicontinuas inversas también sufren de frustración de empaque, pero en mucho menor grado que H II (Seddon & # 38 Templer, 1993), y como resultado pueden hincharse hasta 80 & # 8197 & # 197 & # 8197kbar & # 87221 cuando se someten a altas presiones (Winter et al. , 1999 ).


Figura 2
La presión tiende a aumentar el orden de la cadena y la extensión de la cadena, aumentando así el grosor de las bicapas planas.

figura 3
Hinchazón de un hexagonal inverso (H II ) fase lipídica. La frustración del empaquetamiento de la cadena aumenta a medida que aumenta el diámetro de las micelas inversas cilíndricas empaquetadas hexagonalmente. Esto se puede acomodar hasta cierto punto, pero no se pueden formar huecos (mostrados en rojo) en la estructura, lo que limita la extensión del hinchamiento inducido por la presión.

El efecto de la presión sobre las estructuras de tipo I (curvatura normal) es mucho más difícil de predecir, ya que el orden de la cadena creará una interacción compleja entre la extensión de la cadena, que tenderá a aumentar el parámetro de la red y una disminución en la sección transversal de la cadena lipídica. área, que tenderá a aumentar la magnitud de la curvatura interfacial positiva y así reducir el parámetro de la red. Se han realizado muy pocos experimentos de alta presión en fases cristalinas líquidas liotrópicas de curvatura tipo I, pero los resultados experimentales (Paccamiccio et al. , 2006) han demostrado que la presión puede inducir una reducción pequeña pero significativa en el parámetro reticular del I a 3 D hexagonal bidimensional cúbico bicontinuo (H I ) y Pm 3 norte fases micelares cúbicas de tipo I exhibidas por cloruro de dodeciltrimetilamonio hidratado (DTAC). En todas estas estructuras se observó un cambio de alrededor de 0,5 & # 82111 & # 8197 & # 197 & # 8197kbar & # 87221.

En rangos de presión más grandes, la presión también puede impulsar cambios de fase entre estructuras lipídicas con curvaturas interfaciales significativamente diferentes. Esto ocurrirá cuando el cambio inducido por la presión en la curvatura preferida de las moléculas de lípidos sea suficiente para hacer una fase alternativa más favorable energéticamente. Como se describió anteriormente, el aumento de la presión tiende a aumentar la curvatura interfacial preferida para una monocapa de lípidos y, por lo tanto, para los sistemas de tipo I, la presión impulsará las transiciones de fase a estructuras con una curvatura interfacial más grande ( p.ej. laminar a H I ). Por el contrario, los sistemas de tipo II tienen una curvatura interfacial negativa, por lo que la presión impulsa las transiciones a estructuras con una curvatura de menor magnitud (más positiva) ( p.ej. H II a laminar).

Se ha visto que la presión impulsa las transformaciones de fase en DTAC de un cúbico bicontinuo de tipo I a un H I estructura, y de la H I fase a una Pm 3 norte estructura cúbica micelar (Paccamiccio et al. , 2006) en ambos casos, la presión induce una transición de fase a una estructura con una curvatura de tipo I más alta.

Los cambios de fase inducidos por la presión en los sistemas de lípidos de tipo II se han estudiado mucho más ampliamente que los ejemplos de tipo I. Se ha observado que la presión impulsa las transiciones de fase entre una amplia gama de estructuras de tipo II, y la presión siempre provoca una reducción en la magnitud de la curvatura interfacial (Tyler et al. , 2011 Tang et al. , 2012 , 2014 ).

Cabe señalar que el efecto de aumentar la presión sobre la estructura de los lípidos y los conjuntos de lípidos es generalmente cualitativamente similar al efecto de disminuir la temperatura (Brooks et al. , 2011). Sin embargo, en un límite de transición de fase (donde la energía libre cambia, & # 916 GRAMO , para la transición es cero), esta relación se puede cuantificar utilizando la ecuación de Clapeyron [ecuación (1)] para determinar la dependencia de la presión de una temperatura de transición de fase lipídica, T t

donde & # 916 S metro , Δ H metro y & # 916 V metro son la entropía de transición molar, la entalpía y los cambios de volumen, respectivamente. Estos parámetros pueden medirse a, o muy cerca, de la presión atmosférica, utilizando calorimetría diferencial de barrido (DSC) para determinar T t , Δ S metro y & # 916 H metro y calorimetría de perturbación de presión (PPC) para medir T t y & # 916 V metro . Δ S metro y & # 916 V metro generalmente se puede suponer que es independiente de la presión (o que tiene la misma dependencia de la presión) hasta alrededor de 200 & # 8197MPa, por lo que la ecuación de Clapeyron predice una relación lineal entre la temperatura de transición y la presión.

2.2. Estructura bicapa

Además de su papel estructural, una función clave de las biomembranas es proporcionar una matriz lipídica bidimensional activa dentro de la cual pueden tener lugar las reacciones. Se cree que la organización lateral dinámica y la estructura en estas membranas juegan un papel clave en la regulación de una amplia gama de procesos celulares (Staubach & # 38 Hanisch, 2011 Bethani et al. , 2010) y la presión puede jugar un papel clave en la investigación de este ordenamiento.

Además de influir en el comportamiento de la fase mesoscópica de los lípidos, la presión puede provocar cambios más sutiles en la estructura de las bicapas lipídicas y tiene un efecto significativo sobre la micromecánica de las membranas. Como se describió anteriormente, el aumento de la presión provoca un mayor orden de la cadena de hidrocarburos y, para las bicapas lipídicas planas, esto tenderá a conducir a un aumento en el espesor de la bicapa, acompañado de una reducción del área por cadena de hidrocarburo.

Las altas presiones pueden hacer que las bicapas lamelares de fluido de un solo componente, donde las cadenas de hidrocarburos se funden de manera efectiva, experimenten una transición de fase a una estructura de gel laminar (Cheng et al. , 1996 Shaw et al. , 2012), donde las cadenas de hidrocarburos ahora se fijan en posiciones de celosía específicas en casi todos los trans Se han utilizado experimentos de conformación y dinámica de alta presión para sondear el mecanismo de las transiciones de fase de fluido y gel (Cheng & # 38 Caffrey, 1996). Sin embargo, incluso los cambios de presión que son demasiado pequeños para inducir la gelificación de una bicapa fluida tienden a provocar un hinchamiento de la bicapa debido a la extensión de la cadena, con un cambio en el espesor de la bicapa de menos de 2 & # 8197 & # 197 & # 8197kbar & # 87221.

Como se mencionó anteriormente, se cree que la estructuración lateral en las biomembranas y su efecto sobre la función y regulación de las proteínas es una propiedad clave de las membranas celulares. Las membranas modelo se han utilizado ampliamente para obtener una valiosa información sobre el ordenamiento lateral en bicapas (Veatch et al. , 2004) y la presión es ideal para desencadenar este tipo de estructuración debido a las rápidas escalas de tiempo características. En bicapas hechas de mezclas binarias de lípidos con diferentes temperaturas de fusión de la cadena (y así, como lo muestra la ecuación de Clapeyron, diferentes presiones de fusión de la cadena a una temperatura fija), se ha demostrado que la presión induce la separación de fases entre las estructuras de fluido y gel (Winter & # 38 Jeworrek, 2009). Las mezclas ternarias de un lípido de alto punto de fusión, lípido de baja temperatura de fusión y colesterol pueden exhibir coexistencia entre dos fases fluidas diferentes, dominios líquidos desordenados (donde las cadenas de hidrocarburos lipídicos están fundidas, como en un L α fase) y líquido ordenado (L o ) dominios (Veatch et al. , 2004) (donde los lípidos exhiben una rápida difusión dentro de la bicapa pero las cadenas de hidrocarburos muestran un alto grado de ordenamiento conformacional) (Fig. & # 1604). Recientemente se ha demostrado que la presión se puede utilizar para impulsar la separación de fases líquidas y líquidas (Nicolini et al. , 2006 Jeworrek et al. , 2008), y esta coexistencia se puede probar utilizando tanto la difracción de rayos X de ángulo pequeño como la microscopía (Nicolini et al. , 2006 Tayebi et al. , 2012). Actualmente hay una cantidad significativa de trabajo en curso destinado a dilucidar los parámetros biofísicos que determinan el alcance, la estabilidad y la cinética de la estructuración de la membrana modelo, y vincular esto con el ordenamiento dinámico en las membranas biológicas. Es probable que los experimentos de alta presión y de salto de presión sean extremadamente importantes para desbloquear los cuellos de botella asociados con la activación rápida de estos tipos de cambios estructurales y tienen el potencial de respaldar una amplia gama de emocionantes estudios estructurales de membranas dinámicas.


Figura 4
La presión puede impulsar la separación entre las fases fluidas coexistentes en mezclas de lípidos ternarios. El aumento de la presión provoca el ordenamiento de las cadenas de lípidos, lo que conduce a la asociación de los lípidos de punto de fusión más alto (verde) y el colesterol (barras grises) para formar dominios ordenados en líquido, coexistiendo con dominios desordenados en líquido formados principalmente a partir del lípido de punto de fusión más bajo (azul). .

Los cambios en la estructura de una membrana provocarán inevitablemente cambios en las propiedades micromecánicas de la membrana. Los parámetros fundamentales que sustentan la micromecánica de una membrana se describen mediante la ecuación (2) para la energía elástica de curvatura, gramo C , de una monocapa lipídica (Helfrich, 1973)

dónde H = ( C 1  +  C 2 ) y K = C 1 C 2 son la media media y las curvaturas gaussianas, respectivamente C 1 y C 2 son las principales curvaturas en un punto dado de la superficie H 0 es la curvatura media espontánea y & # 954 y & # 954 GRAMO son los módulos de curvatura media y gaussiana, respectivamente. El módulo de curvatura medio describe el costo energético de cambiar la curvatura media de una monocapa, mientras que el módulo gaussiano representa la energía necesaria para cambiar la curvatura gaussiana.

Los parámetros correspondientes se pueden encontrar para una bicapa: la curvatura preferida H 0 para una bicapa simétrica debe ser cero, y se espera que el módulo de flexión de la bicapa & # 954 b sea simplemente el doble del módulo de monocapa (Seddon & # 38 Templer, 1993). Sin embargo, la expresión para el módulo gaussiano bicapa`` es más compleja (Helfrich & # 38 Rennschuh, 1990)

Aquí, todos los parámetros del lado derecho se refieren a una monocapa, incluida l , el espesor de la monocapa. & # 954 by se refieren al costo energético de exactamente las mismas deformaciones físicas descritas anteriormente para la monocapa.

Se ha sugerido que la presión aumenta el módulo de flexión de la monocapa (Kawabata et al. , 2004) y se espera que la presión también aumente el módulo de flexión de una bicapa (Shearman et al. , 2006), debido al engrosamiento de la bicapa inducido por la presión, como se discutió anteriormente. Se ha demostrado que la presión aumenta la curvatura espontánea de la monocapa, H 0 (Invierno et al. , 1999). Sin embargo, vale la pena señalar que los lípidos que tienden a formar estructuras inversas tienen una curvatura espontánea negativa, por lo que la presión tenderá a disminuir la magnitud de esta curvatura negativa. La observación de que la presión puede estabilizar fases lipídicas cúbicas bicontinuas (Duesing et al. , 1997) que tienen una curvatura gaussiana negativa sugiere que la presión también aumenta el módulo gaussiano bicapa (reduciendo así la energía elástica de curvatura bicapa). Sin embargo, para los lípidos que tienden a formar fases inversas, el efecto de la presión sobre el módulo gaussiano monocapa es mucho menos claro. En la ecuación (3), la presión aumenta & # 954 pero disminuye la magnitud de H 0 , que tenderá a cancelarse, lo que dificulta predecir el efecto en & # 954 GRAMO .

2.3. Conjuntos de lípidos y proteínas

Si bien alguna vez se pensó que las membranas biológicas consistían en proteínas de membrana activas que están asociadas con una matriz estructural de lípidos pasivos, ahora se sabe que las concentraciones de proteínas pueden alcanzar hasta el 30 & # 8197% en peso en las membranas, y tanto las proteínas como los lípidos juegan un papel importante. papel muy activo en los procesos celulares (Staubach & # 38 Hanisch, 2011 Bethani et al. , 2010 ).

Las interacciones entre lípidos y proteínas se han reconocido cada vez más como críticas para una variedad de procesos celulares y eventos de señalización, y ahora se reconoce que los lípidos y las proteínas de membrana deben interactuar fuertemente tanto física como químicamente (Lee, 2003 Charalambous et al. , 2012). Es probable que la respuesta estructural general de las biomembranas a influencias externas, como la presión, sea el resultado del estrecho acoplamiento de cambios tanto en los lípidos como en las proteínas, y sus interacciones. Hasta ahora se han realizado relativamente pocos estudios sobre la influencia de la presión en los conjuntos de lípidos y proteínas modelo, pero un control cuidadoso de la temperatura y la presión tiene el potencial de facilitar la investigación futura de los mecanismos y la dinámica de la coestructuración de lípidos y proteínas. A continuación se describen dos ejemplos clave del efecto de la presión sobre las estructuras de lípidos y proteínas.

Incorporación del citocromo de proteína de membrana periférica pequeña C en fases lipídicas cúbicas bicontinuas inversas formadas a partir de monooleína inducen cambios significativos en el comportamiento estructural de la membrana (Lendermann & # 38 Winter, 2003). La incorporación de bajas concentraciones de proteína cambia los límites de la fase de temperatura y presión para la monooleína. A concentraciones de proteína más altas, la formación de una fase cúbica no centrífugo del grupo espacial PAG 4 3 32 se observa. Se cree que esta estructura es similar a la de la fase cúbica bicontinua del giroide, con un canal de agua reemplazado por micelas inversas en los puntos de unión y con una molécula de citocromo. C colocado en el centro de cada micela inversa, lo que sugiere que la interacción entre lípidos y proteínas impulsa un aumento en la magnitud de la curvatura inversa de la membrana. La estabilidad a la presión de esta estructura novedosa aumenta a medida que aumenta la concentración de proteína, lo que se atribuye a interacciones atractivas de proteínas y grupos de cabeza de lípidos. Se han utilizado experimentos de rayos X con salto de presión para probar la cinética de las transiciones de fase en este sistema (Kraineva et al. , 2005) y muestran tiempos de transición significativamente más lentos que en la monooleína pura. Una vez más, es probable que esto se deba a las atractivas interacciones entre lípidos y proteínas y a la necesidad de coestructurar los dos componentes.

Monooleína con la proteína de membrana integral bacterio & # 173rhodopsin incorporada (Kulkarni et al. , 2013) también muestra un comportamiento estructural de presión y temperatura significativamente diferente al de la monooleína pura. La inclusión de la proteína aumenta la estabilidad de la presión de las estructuras cúbicas bicontinuas observadas en relación con las fases laminares planas, lo que sugiere de nuevo que las interacciones entre proteínas y lípidos presentes aquí favorecen la curvatura inversa de la membrana. Se han observado fases cúbicas bicontinuas muy hinchadas (con parámetros de red de más de 200 & # 8197 & # 197) a alta presión en estas mezclas, tanto en equilibrio como durante experimentos de difracción de rayos X con salto de presión.

2.4. Experimentos cinéticos de salto de presión y transformación estructural

Una de las ventajas significativas de la presión sobre otros factores desencadenantes de cambio de estructura, como la temperatura o la variación de la composición, es que la presión se puede cambiar extremadamente rápido: en varios instrumentos de alta presión, se pueden realizar saltos de presión de varios cientos de MPa en 5 & # 8197ms. (Arroyos et al. , 2010 Woenckhaus et al. , 2000) y, en algunos casos, los saltos de presión se pueden realizar en una escala de tiempo inferior a microsegundos (Dumont et al. , 2009) (ver más abajo para un análisis más detallado de la tecnología de alta presión). Tales cambios rápidos permiten que el disparador termodinámico se desacople de muchos cambios en la estructura del ensamblaje de biomoléculas y membranas, lo que permite caracterizar el comportamiento fuera de equilibrio de las transiciones estructurales rápidas en estos sistemas.

Los saltos de presión se han utilizado para producir información valiosa sobre la cinética y los intermedios involucrados en las transiciones estructurales de varios de los sistemas discutidos anteriormente (Kriechbaum et al. , 1993 Conn et al. , 2008 Jeworrek et al. , 2008 Kulkarni et al. , 2013). Recientemente, se ha logrado un avance significativo en el modelado cuantitativo de las transiciones de fase lipídica con el desarrollo de un modelo cinético para las transiciones estructurales lipídicas que implican un cambio de curvatura monocapa (Squires et al. , 2009). Si se puede ajustar un modelo cinético adecuado para describir una transición estructural, la velocidad a la que tiene lugar la transición puede relacionarse con el volumen de activación, & # 916 V a

dónde k ( pag ) y k 0 son las constantes de velocidad a presión relativa pag y presión atmosférica, respectivamente, R es la constante universal de los gases y T es la temperatura. El volumen de activación se puede interpretar utilizando la teoría del estado de transición como la diferencia de volumen entre el estado de transición y el volumen de los reactivos a la misma presión. Esto se puede considerar como una barrera elástica para la transformación, de la misma manera que la energía de activación para una reacción se considera una barrera energética térmica para una reacción.

3. Instrumentación de alta presión

Como se describió anteriormente, la presión puede desempeñar un papel clave en el estudio de la estructura de los conjuntos de membranas dinámicas y la biología que sustentan. Para aprovechar al máximo la tecnología de alta presión, es esencial que esté acoplada a técnicas de sonda de estructura rápida, y se ha centrado una gran cantidad de trabajo en vincular la instrumentación de alta presión con las instalaciones de difracción y dispersión de rayos X de sincrotrón (Woenckhaus et al. , 2000 Ando et al. , 2008 Krywka et al. , 2008 Brooks et al. , 2010 Fourme et al. , 2012, 2011 Girard et al. , 2010). Esto también ha facilitado avances significativos en la accesibilidad de la instrumentación de alta presión (Brooks et al. , 2010). Además, la RMN de alta presión (Bonev & # 38 Morrow, 1997 B Peng & # 38 Jonas, 1992), microscopía óptica (Nicolini et al. , 2006 Vass et al. , 2010) y espectroscopia (Schiewek et al. , 2007 Dumont et al. , 2009) han experimentado un rápido desarrollo y proporcionan datos estructurales altamente complementarios a los experimentos de rayos X.

3.1. Celdas de muestra de alta presión para dispersión de rayos X de ángulo pequeño (SAXS)

La difracción de rayos X de ángulo pequeño es ideal para sondear la estructura de los conjuntos de membranas lipídicas liotrópicas, que se ordenan en la nanoescala. Además, SAXS se ha empleado cada vez más para estudiar las estructuras de proteínas y conjuntos de proteínas (Petoukhov et al. , 2012 Tuukkanen y # 38 Svergun, 2014).

Las celdas de muestras de alta presión SAXS deben diseñarse cuidadosamente para contener volúmenes de muestra relativamente grandes (varios microlitros) a alta presión, al tiempo que permiten resolver un amplio rango de ángulos de dispersión. Dentro de estas limitaciones, varios grupos han desarrollado celdas de presión SAXS durante más de 20 & # 8197 años (por lo que et al. , 1992 Mencke et al. , 1993 Pressl et al. , 1997 Ando et al. , 2008 Krywka et al. , 2008 Brooks et al. , 2010) para abordar la necesidad de un control fino de la presión de los sistemas de materia blanda.

Se alcanzó un hito significativo con el desarrollo de un sistema celular robusto y versátil por Woenckhaus et al. (2000). Este sistema puede realizar experimentos de presión estática y cinética en el rango 0 & # 82110.7 & # 8197GPa (7 & # 8197kbar) y & # 872240 & # 8211100 & # 176C. La presión se genera y se controla vía una red hidráulica de agua que emplea dos válvulas accionadas por aire para iniciar los saltos de presión, una para saltos de presión creciente y otra para saltos de presión decreciente. El enfoque de la red hidráulica permite realizar saltos de presión en tan solo 5 & # 8197ms. Las ventanas de la celda son de diamante de 0,8 y # 8197 mm de espesor, lo que elimina el riesgo de formación de polvo tóxico asociado con el berilio. Las especificaciones de este sistema de presión han establecido un punto de referencia para las celdas de presión de materia condensada blanda más recientes, y ha facilitado una amplia gama de experimentos de alta presión y salto de presión en membranas lipídicas (Conn et al. , 2008 Eisenbl & # 228tter & # 38 Winter, 2006 Jeworrek et al. , 2008 Kraineva et al. , 2005 Tang et al. , 2012 Kulkarni et al. , 2013 ).

También se han realizado desarrollos recientes en la contención de muestras (Ando et al. , 2008), ventanas con baja dispersión parasitaria (Wang et al. , 2012) y puertos de carga de muestras (Krywka et al. , 2008). El desarrollo de un puerto de carga de muestras dedicado (en contraste con las celdas anteriores, que generalmente requerían que las muestras se carguen a través de uno de los puertos de la ventana de rayos X) tiene la ventaja significativa de permitir una sustracción precisa de la dispersión de fondo debido a los rayos X ventanas.

Recientemente hemos desarrollado un sistema SAXS de alta presión basado en la línea de luz I22, Diamond Light Source, Reino Unido (Brooks et al. , 2010). Se pueden realizar experimentos de salto de presión estática y de milisegundos en el rango de 0,1 & # 8211500 & # 8197MPa y entre & # 872220 y 120 & # 176C. El sistema está completamente automatizado, integrado con la línea de luz y disponible para todos los usuarios de I22, lo que abre la tecnología de alta presión a una base de usuarios extremadamente amplia.

3.2. Celdas de yunque de diamante (DAC)

Las celdas de yunque de diamante (Katrusiak, 2008) se emplean habitualmente para experimentos de alta presión que requieren una presión de hasta 100 & # 8197GPa (10 5 & # 8197bar). Consisten en dos yunques opuestos que comprimen una muestra contenida en una junta de metal. Los DAC más simples aplican una presión relativamente pequeña a los diamantes. vía un sistema de tornillo, y esta presión se intensifica por la forma del diamante y se aplica a la muestra. Recientemente se han logrado avances significativos en el diseño de DAC, particularmente con el desarrollo de celdas impulsadas por membranas de gas, donde un "globo" lleno de gas aplica la presión inicial, en lugar de una abrazadera impulsada por tornillos. Esto tiene varias ventajas, incluida la operación remota, la capacidad de aplicar pequeños incrementos de presión controlados y presiones alcanzables más altas debido a la ausencia de fricción del tornillo. El volumen interno de un DAC es muy pequeño, por lo que las mediciones de presión generalmente se realizan colocando un pequeño cristal de rubí o cuarzo en la muestra y midiendo la posición del R 1 máximo de fluorescencia de rubí (Piermarini et al. , 1975) o vibración IR de cuarzo (Wong et al. , 1985), que se desplazan con la presión, ofreciendo una resolución de alrededor de 20 & # 8197MPa (Czeslik et al. , 1998). Recientemente ha habido un interés significativo en el desarrollo de transductores de presión alternativos para su uso en DAC con mayor resolución (Oger et al. , 2006 Picard et al. , 2006 ).

Los DAC han demostrado ser extremadamente valiosos para estudiar el comportamiento de las proteínas a alta presión (Silva et al. , 2001). Si bien las presiones accesibles con DAC son a menudo significativamente más altas que las requeridas para estudiar los cambios en la estructura de la membrana, se han llevado a cabo estudios de lípidos de hasta 2 & # 8197GPa (Czeslik et al. , 1998 Reis & # 38 Winter, 1998) y avances recientes, particularmente en detección de presión (Picard et al. , 2006) y control (Oger et al. , 2006), puede abrir nuevas vías en la investigación de lípidos y membranas de muy alta presión. Una ventaja significativa de los DAC sobre las células SAXS de materia blanda descritas anteriormente es que se pueden resolver ángulos de difracción mucho más amplios, ya que los yunques de diamante son relativamente transparentes a los rayos X. Los experimentos DAC han demostrado ser particularmente valiosos en cristalografía macromolecular (Fourme et al. , 2012) y esta técnica ahora está ampliamente disponible en líneas de luz de sincrotrón que ofrecen condiciones extremas (Fourme et al. , 2011 ).

3.3. Técnicas complementarias de sonda de estructura de alta presión

3.3.1. RMN de alta presión

Se han informado varios sistemas de RMN de alta presión (Fourme et al. , 2012). Sin embargo, la sonda de RMN de alta presión desarrollada por Bonev & # 38 Morrow (1997 B ) fue diseñado específicamente para su uso con materia blanda y se ha utilizado ampliamente para estudiar muestras de membranas modelo (Bonev & # 38 Morrow, 1997 a Fiech et al. , 1998). Esta sonda permite estudios hasta 300 & # 8197MPa a temperaturas entre & # 872220 y 100 & # 176C.

3.3.2. Microscopía óptica de alta presión

Ha habido desarrollos recientes interesantes en el diseño y uso de sistemas de microscopía óptica de alta presión, lo que permite el campo brillante (Frey et al. , 2006 Nishiyama & # 38 Kojima, 2012), polarizante (Reck et al. , 1998), fluorescencia (Nicolini et al. , 2006 Vass et al. , 2010 Nishiyama et al. , 2009) y de una sola molécula (Vass et al. , 2013) microscopía, a presiones tan altas como 700 & # 8197MPa (Vass et al. , 2010). Varias de estas celdas se han basado nuevamente en principios de diseño similares a las celdas SAXS de materia blanda descritas anteriormente (Reck et al. , 1998). Sin embargo, también ha habido una celda de presión óptica muy exitosa construida con tubos capilares de sílice fundida de calibre estrecho (Nicolini et al. , 2006). Una consideración importante para la microscopía de alta resolución es permitir un acceso cercano de la lente del objetivo del microscopio a la muestra mientras se mantiene la estabilidad de la presión de la celda. La distancia de trabajo de las lentes objetivo disminuye a medida que aumenta su aumento, pero se ha logrado un aumento de hasta 40 y # 215 utilizando una celda de tipo cuerpo / ventana de metal (Frey et al. , 2006 Nishiyama et al. , 2009), y 63 & # 215 usando el sistema de tubo capilar mencionado anteriormente (Nicolini et al. , 2006 ).

3.3.3. Celdas de presión de espectroscopia

Se han desarrollado varias celdas de materia blanda de alta presión para su uso con la espectroscopia de infrarrojos por transformada de Fourier (FT & # 8211IR), siguiendo un diseño similar a las celdas SAXS de materia blanda anteriores (Schiewek et al. , 2007) y utilizando una red hidráulica para generar presión. Estos se han utilizado a presiones estáticas de hasta 600 & # 8197MPa y para saltos de presión (Schiewek et al. , 2007). Además, los DAC se han utilizado con éxito para experimentos FT & # 8211IR (Czeslik et al. , 1998 ).

La velocidad de los saltos de presión generados por un sistema de válvula hidráulica como se describe arriba está limitada a alrededor de 5 & # 8197ms por el tiempo requerido para abrir la válvula de salto de presión. Si bien esto es considerablemente más rápido que muchas transformaciones biomoleculares, algunos cambios de estructura (particularmente cambios de estructura de proteínas) pueden ocurrir en una escala de tiempo más corta, lo que ha impulsado el desarrollo de una tecnología de salto de presión más rápida.

Las celdas de presión de espectroscopia se han desarrollado con un pistón de pila piezoeléctrico integrado en el cuerpo de la celda (Pearson et al. , 2002) que pueden generar saltos de presión extremadamente rápidos. Aunque el movimiento del pistón limita la presión que se puede alcanzar, se pueden realizar saltos de hasta 20 & # 8197MPa en 150 & # 8197 & # 181s mientras se sondea la muestra mediante espectroscopia de absorción o fluorescencia.

Los diafragmas de ruptura se han utilizado durante muchos años para generar saltos rápidos de presión hacia abajo (Davis & # 38 Gutfreund, 1976) pero recientemente ha habido un avance significativo en la tecnología de membrana de ruptura con el desarrollo de un diafragma de ruptura con ruptura eléctrica (Dumont et al. , 2009). Esto permite que la ruptura sea inducida a una presión ajustada con precisión, y se pueden realizar saltos de presión hacia abajo de hasta 250 & # 8197MPa en menos de 700 & # 8197ns, proporcionando los saltos de presión más rápidos disponibles actualmente.

4. Observaciones finales

La alta presión ha demostrado ser una herramienta biofísica extremadamente poderosa para estudiar el comportamiento estructural de los conjuntos de membranas. Ha facilitado la investigación de los mecanismos de cambios estructurales a gran escala en las mesofases de los lípidos, la cinética de la separación de fases y el ordenamiento con bicapas, y la estabilidad de los conjuntos de lípidos y proteínas, entre una amplia variedad de otros experimentos. Los desarrollos en instrumentación de alta presión continúan ampliando el alcance de la tecnología de presión, tanto en términos de las muestras a las que se puede aplicar como de los grupos que pueden hacer uso de ella. Con nuevos y emocionantes desarrollos, como la tecnología de salto de presión ultrarrápido y la microscopía de alta presión de alta resolución, es evidente que habrá una amplia gama de experimentos en un futuro próximo que proporcionarán una visión cada vez mayor de la estructura y función de las membranas biológicas dinámicas. .

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Autoorganización: el fundamento de la biología celular

La autoorganización se refiere al surgimiento de un orden general en el tiempo y el espacio de un sistema dado que resulta de las interacciones colectivas de sus componentes individuales. Este concepto ha sido ampliamente reconocido como un principio fundamental en la formación de patrones para sistemas multicomponente del mundo físico, químico y biológico. Se puede distinguir del autoensamblaje por la entrada constante de energía requerida para mantener el orden, y la autoorganización, por lo tanto, ocurre típicamente en sistemas disipativos o de desequilibrio. Las células, con su consumo constante de energía y miríadas de interacciones locales entre distintas proteínas, lípidos, carbohidratos y ácidos nucleicos, representan el campo de juego perfecto para la autoorganización. Por lo tanto, no sorprende que muchas propiedades y características de los sistemas autoorganizados, como la formación espontánea de patrones, el acoplamiento no lineal de reacciones, interruptores biestables, ondas y oscilaciones, se encuentren en todos los aspectos de la biología celular moderna. En última instancia, la autoorganización se encuentra en el corazón de la robustez y adaptabilidad que se encuentran en la organización celular y orgánica y, por lo tanto, constituye una base fundamental para la selección natural y la evolución.

Este artículo es parte del tema "Autoorganización en biología celular".

En el nuevo milenio, la biología celular se ha visto muy influenciada por una renovada aparición de la biología de sistemas en sus diversas manifestaciones. Las nuevas direcciones de la investigación han sido impulsadas en gran medida por dos líneas de enfoques de sistemas. Por un lado, diversas técnicas "ómicas" han llevado al montaje de extensos inventarios de genes, perfiles de expresión, proteínas y modificaciones de proteínas, así como interacciones genéticas y proteicas. Sin embargo, también se ha vuelto obvio que las cadenas lineales de causalidad y los inventarios simples de componentes no son suficientes para explicar los patrones dinámicos espaciales y temporales típicos de las complejas interacciones que controlan las células individuales, y mucho menos los organismos completos. Por otro lado, la biología de sistemas de mesoescala, como Marc Kirschner describió elocuentemente hace más de una década [1], se basa en una combinación de enfoques de visualización y perturbación celular cuantitativa y la aplicación de conceptos teóricos desde la física, las matemáticas y la teoría de la información a la biología. sistemas. Este aspecto de la biología de sistemas se ha visto impulsado en gran medida por los desarrollos revolucionarios en la microscopía de fluorescencia y nos ha permitido obtener una comprensión conceptual de muchos comportamientos no intuitivos que son inherentes a la fisiología celular. Uno de los temas generales que ha surgido de los muchos estudios detallados en biología de sistemas de mesoescala durante las últimas décadas es que casi todas las estructuras, patrones y comportamientos celulares y subcelulares se basan en cierta medida en la autoorganización.

La autoorganización se refiere al surgimiento de un orden general en el tiempo y el espacio de un sistema dado que resulta de las interacciones colectivas de sus componentes individuales. Este concepto ha sido ampliamente reconocido como un principio fundamental en la formación de patrones para sistemas multicomponente del mundo físico, químico y biológico. Se puede distinguir del autoensamblaje por la entrada constante de energía requerida para mantener el orden, y la autoorganización, por lo tanto, ocurre típicamente en sistemas disipativos o de desequilibrio. Las células, con su consumo constante de energía y miríadas de interacciones locales entre distintas proteínas, lípidos, carbohidratos y ácidos nucleicos, representan el campo de juego perfecto para la autoorganización. Por lo tanto, no sorprende que muchas propiedades y características de los sistemas autoorganizados, como la formación espontánea de patrones, el acoplamiento no lineal de reacciones, interruptores biestables, ondas y oscilaciones, se encuentren en todos los aspectos de la biología celular moderna. En última instancia, la autoorganización se encuentra en el corazón de la robustez y adaptabilidad que se encuentran en la organización celular y orgánica y, por lo tanto, constituye una base fundamental para la selección natural y la evolución.

El concepto de autoorganización y sus múltiples implementaciones en sistemas biológicos se resumieron maravillosamente hace una década en una revisión fundamental de Karsenti [2]. Ahora, después de diez años más de inventariar sistemáticamente los componentes celulares mediante varios enfoques ómicos y el rápido desarrollo de técnicas de microscopía, la biología celular y la biología de sistemas se encuentran en una etapa en la que principios fundamentales como la autoorganización pueden caracterizarse cuantitativamente. Esta comprensión conceptual se puede aplicar a sistemas sintéticos o de ingeniería con el potencial de generar una multitud de comportamientos celulares novedosos y controlados con precisión. La integración actual de sistemas y biología sintética está destinada a moldear nuestra comprensión futura de la organización celular y, en última instancia, de los principios de la vida. Este número temático sobre la autoorganización en biología celular tiene como objetivo resumir los enfoques actuales e identificar los desafíos futuros en el estudio y la aplicación de la autoorganización en sistemas biológicos naturales y sintéticos. Las contribuciones se organizan en tres secciones, que tratan de la autoorganización a nivel molecular, en células completas y de las implicaciones físicas y evolutivas de la autoorganización. Es importante destacar que esta separación entre secciones es, por definición, muy suave, ya que el surgimiento de propiedades de circuitos autoorganizados a menudo ocurre al unir diferentes escalas y niveles de complejidad.

Al centrarse en las descripciones cuantitativas de la autoorganización en los sistemas biológicos, es esencial revisar los conceptos físicos y matemáticos subyacentes de las transiciones de fase y los sistemas de reacción-difusión. Esto se proporciona en la revisión de Saha & amp Galic [3], que describe la física de las transiciones de fase mediante un enfoque de mecánica estadística clásica. Aquí, un punto importante para los sistemas biológicos es extender esta descripción clásica a los sistemas dinámicos, lo que a su vez requiere considerar las transiciones de fase en los sistemas disipativos. En general, las transiciones de fase en las membranas y también en el citoplasma son un campo de investigación rico, que también se discute a nivel celular en las contribuciones de Sych et al. [4] y Wheeler & amp Hyman [5]. Además de introducir las transiciones de fase, la revisión de Saha y Galic [3] proporciona una breve discusión de los sistemas de reacción-difusión. Desde el trabajo fundamental de Turing [6], los sistemas de reacción-difusión se reconocen como una descripción fundamental para la formación de patrones y la autoorganización en biología. Para ejemplificar la profundidad de tales sistemas, Saha y Galic [3] proporcionan no solo una descripción analítica sino también ejemplos de sistemas de uno y dos componentes y discuten la perspectiva biológica de los sistemas de reacción-difusión.

Uno de los ejemplos mejor entendidos de autoorganización en biología a nivel molecular es el sistema de proteínas Min, representado por tres artículos posteriores en este número. Las proteínas mínimas van y vienen de un estado citoplásmico a uno de membrana, un proceso dinámico que se autoorganiza en oscilaciones que definen la posición de la división celular en las bacterias. Schwille y colaboradores [7] introducen el sistema Min desde el punto de vista experimental, donde el enfoque común de ingeniería inversa de la compleja situación biológica es un excelente ejemplo utilizando herramientas genéticas para obtener conocimientos fundamentales sobre las dependencias funcionales de los diferentes jugadores. Siguiendo literalmente a Richard Feynman: 'Lo que no puedo crear, no lo entiendo' (una frase que se encuentra escrita en su pizarra en el momento de su muerte en 1988 de una foto en los archivos de Caltech), los enfoques de reconstitución modernos nos permiten diseñar el Min sistema in vitro, donde se pueden reproducir y estudiar muchas características del sistema bacteriano con un detalle excepcional. Sin embargo, según Schwille y colaboradores [7], para lograr avances reales en la investigación de situaciones de vida complejas, se debe buscar una síntesis bien equilibrada de los enfoques de ingeniería inversa y avanzada.Además de estos conocimientos experimentales, el sistema Min también es atractivo para enfoques teóricos detallados, según lo revisado por Wettmann y Kruse [8]. El enfoque más popular para modelar la dinámica de la autoorganización de la proteína Min se basa en sistemas de reacción-difusión, que se han utilizado con éxito para desarrollar simulaciones analíticas y estocásticas para reproducir observaciones experimentales típicas como ondas estacionarias y viajeras, pero también espirales giratorias. Un elemento clave de estas teorías es el concepto de cooperatividad, que se refleja matemáticamente en términos no lineales. Actualmente, más avances en nuestra comprensión del sistema Min requerirían más detalles experimentales, como constantes de velocidad precisas, un mejor conocimiento de los detalles moleculares que subyacen a la cooperatividad requerida para los enfoques teóricos y más avances en los sistemas reconstituidos para reflejar aún mejor la en vivo situación. Frey y colaboradores [9] proponen un enfoque diferente sobre la descripción teórica del sistema Min, quienes explican que el enfoque activador-inhibidor de uso frecuente, que conduce al agotamiento del sustrato, no es la única forma de describir la reacción. –Sistemas de difusión. En cambio, combinar procesos de difusión con reacciones generales que solo reflejan un cambio en el estado conformacional de las proteínas podría ser más apropiado para el sistema Min. Desde este punto de vista, el proceso clave para la dinámica observada es un transporte dirigido, que de hecho puede lograrse mediante una simple difusión a lo largo de gradientes citosólicos definidos. Por lo tanto, los patrones no se deben necesariamente a la producción y degradación de proteínas, sino que simplemente reflejan diferentes estados posibles de una proteína, como unida a la membrana o citosólica. Como ejemplos, los sistemas auto-organizados de proteínas Min, proteínas Cdc42 y PAR se discuten sin utilizar la metodología clásica de activador-inhibidor, pero demostrando la eficiencia del ciclo simple entre diferentes estados. Este enfoque bastante genérico destaca los beneficios de una mirada nueva y fresca en sistemas aparentemente bien descritos para superar las limitaciones actuales.

Mientras Frey y colaboradores [9] discuten un enfoque general para comprender los sistemas de reacción-difusión, Yang & amp Wu [10] se centran en las ondas oscilatorias observadas en la corteza celular. Su revisión proporciona una discusión exhaustiva de las diferentes redes de proteínas que se sabe que dan como resultado ondas de la corteza, como retroalimentaciones positivas y negativas entre GTPasas y la conciencia emergente de una posible interacción entre la curvatura de la membrana y la polimerización de actina. Desde un punto de vista biológico, la cuestión clave que queda por resolver es asignar un papel funcional a tales oscilaciones y ondas corticales. Las funciones discutidas actualmente van desde una relevancia en el almacenamiento de información y la señalización dependiente de la frecuencia hasta escenarios más complejos que involucran la transferencia de información dentro de las redes, hasta el control del tamaño de la celda a través de una conexión entre escalas de longitud y frecuencias de oscilación. Sin embargo, la posibilidad de que las oscilaciones sean meros efectos secundarios de complejidad, sin una función biológica general, no debe ignorarse por completo en el esfuerzo por comprender las ondas y oscilaciones corticales.

Como complemento a la discusión experimental de las ondas corticales de Yang y Wu [10], el artículo de Gov [11] proporciona una descripción teórica detallada que conecta las proteínas que detectan / inducen la curvatura con la forma de la membrana a través de fuerzas activas que deforman y mueven la membrana. El enfoque genérico de este modelo se basa en una minimización de energía libre, ignorando así el acoplamiento hidrodinámico que normalmente conduce a interacciones de largo alcance. La teoría desarrollada aquí acopla el efecto mecánico de cualquier fuerza sobre la membrana con los cambios dinámicos de curvatura esperados, que dan como resultado un reclutamiento de proteínas sensibles a la curvatura. Luego, se puede incluir retroalimentación positiva o negativa si estas proteínas sensibles a la curvatura pueden influir en los procesos iniciales de generación de fuerza. Estas ideas se pueden ilustrar en detalle en diferentes curvaturas de membrana y características de proteínas observadas experimentalmente. Los patrones bien descritos son de hecho predichos por el modelo, como lo demuestra la autoorganización de estructuras como protuberancias de membranas, retracciones de membranas y formación de tubos. Además de estas formas de membrana, el modelo predice correctamente incluso las oscilaciones y ondas de las proteínas.

Todas las contribuciones presentadas anteriormente a este tema se centran en la autoorganización a nivel molecular. Sin embargo, muchos procesos de autoorganización ocurren a nivel celular. Por ejemplo, es bien sabido que la organización de la membrana plasmática depende en gran medida de la formación de dominios locales que están definidos por diferentes fases de la membrana. Römer y colaboradores [4] discuten el conocimiento actual de tales transiciones de fase de membrana y su importancia para la homeostasis de la membrana, con un enfoque en las transiciones de glucoesfingolípidos inducidas por lectina. Aquí, la lectina confina dichos lípidos a áreas de tamaño nanométrico con características similares a las balsas de lípidos. Dependiendo de los detalles, se pueden inducir los lípidos y las lectinas e incluso la curvatura de la membrana, lo que favorece o incluso desencadena la endocitosis.

Pero no es solo a nivel de la membrana donde se ha demostrado que las transiciones de fase son de importancia clave para la organización celular. En su artículo de revisión, Wheeler & amp Hyman [5] discuten las propiedades de los orgánulos líquidos no unidos a la membrana que emergen como condensaciones de proteínas en forma de gotas líquidas. La condensación de estas gotitas es impulsada por proteínas de andamio que generalmente se dividen en dos clases: proteínas con dominios de baja complejidad y proteínas compuestas por múltiples copias de dominios de interacción. Comprender las propiedades emergentes y las transiciones críticas de tales condensados ​​nos permite inferir el estado de las proteínas involucradas. Es posible determinar las características y la regulación de la solubilidad relativa, fosforilación o SUMOilación. Una característica clave de tales condensados ​​es la conexión entre las transiciones de fase física y la función biológica, hasta los efectos directos de la señalización. Actualmente, estos condensados ​​de proteínas intracelulares se estudian con gran detalle, pero aún se sabe poco sobre procesos fundamentales como la nucleación del condensado, el control de la dinámica del condensado, la mezcla del condensado y los compartimentos anidados.

Otro ejemplo de esta conexión directa entre la física y la biología se puede encontrar en la diafonía entre las fuerzas físicas y la señalización bioquímica, como se describe en el artículo de Weiner y colaboradores [12]. Revisan la autoorganización de la polimerización de actina y la contractilidad de la acto-miosina en el contexto de la migración, donde la tensión de la membrana es un actor importante. Similar a las contribuciones de Gov [11] y Yang & amp Wu [10], introducidas anteriormente, se discute la relación entre las fuerzas y la deformación de la membrana, aunque aquí el foco radica en el vínculo directo con la polaridad celular y la migración celular. La conexión conocida entre la polimerización de actina y la contractilidad de la acto-miosina es el punto de partida para discutir la regulación de los pulsos contráctiles observados experimentalmente. Los dos candidatos principales para modelar dicha dinámica son un marcapasos bioquímico y una autoorganización biomecánica impulsada por la retroalimentación. La investigación de la interrelación entre la tensión de la membrana y los eventos de señalización que se desencadenan por variaciones rápidas de tensión favorece la interpretación de que las ondas intracelulares de polimerización y contractilidad de actina son de hecho autoorganizadas por mecanismos de retroalimentación biomecánica.

Tales retroalimentaciones no solo son importantes en la corteza celular, sino también para la organización de las fibras de acto-miosina, como lo discutieron ampliamente Bershadsky y colaboradores [13]. Centrándose en el ensamblaje de acto-miosina y la importancia de las fuerzas para este ensamblaje, esta revisión brinda una descripción detallada de la organización del paquete. Después de discutir la organización del sarcómero muscular, que es muy estable con tiempos de renovación superiores a una hora, la diferencia con las fibras de estrés que contienen miosina II en las células no musculares se hace evidente, ya que son muy dinámicas, con tiempos de renovación más rápidos de un minuto. Estos tiempos de rotación tan rápidos son sorprendentes, ya que las fibras de tensión necesitan soportar tensiones durante escalas de tiempo más largas. Aunque sabemos que en las células no musculares, las fibras se ensamblan con la ayuda de la proteína similar a la formina Fmnl4, cofilina y α-actinina-4, los detalles del ensamblaje de las fibras siguen sin conocerse. Un posible modelo propuesto por Dasbiswas et al. [13] sugiere una analogía con la formación de miofibras al explicar la autoorganización en las células no musculares con una interacción entre los dipolos de fuerza generados por la miosina y la malla de actina que interviene y que proporciona efectivamente el andamio elástico que apoya la alineación del mini-filamento.

Con todos los estudios en biología celular, independientemente de la escala y complejidad del sistema, existe un enigma general: cuando se introducen cambios a largo plazo o a gran escala con enfoques de perturbación clásicos, los circuitos autoorganizados en células y tejidos a menudo se adaptan y puede cambiar a un nuevo estado estable. Si bien este nuevo estado está vinculado funcionalmente a la perturbación original, puede abarcar una multitud de adaptaciones ocultas que pueden interferir con una interpretación correcta de los fenotipos. En este número, Isogai y Danuser, por lo tanto, sugieren complementar las perturbaciones con análisis correlativos de fluctuaciones en sistemas no perturbados [14]. Ilustran este enfoque utilizando la sucesión y cooperación de diferentes nucleadores de actina durante la formación de protuberancias celulares y estructuras de adhesión celular. También proporcionan una discusión general de las ventajas y limitaciones del análisis de fluctuaciones.

En muchos de los ejemplos discutidos hasta ahora, las limitaciones físicas determinan el resultado preciso de los sistemas autoorganizados. Cuando se considera la determinación de la forma de organismos multicelulares y también de sistemas más simples como hongos o mohos limosos, la física a menudo juega un papel morfogenético más directo. En su contribución, Karen Alim considera el papel del flujo de fluidos para dar forma a la arquitectura de red del molde de lodo. Plasmodium polycephalum [15]. En este organismo, las contracciones mediadas por el citoesqueleto crean patrones de flujo en el citoplasma que exhiben oscilaciones de largo alcance y pueden soportar un crecimiento celular muy rápido con hasta 400 µm s -1. Los bucles de retroalimentación subyacentes entre el flujo de fluidos, la forma celular y las funciones citoesqueléticas proporcionan un poderoso ejemplo de un circuito autoorganizado que podría aplicarse a aplicaciones novedosas en sistemas sintéticos.

Como todos los aspectos de la biología, los procesos de autoorganización en las células están sujetos a selección y evolución natural. Hallatschek y colaboradores [16] se centran en la interacción entre la formación de patrones en poblaciones de células microbianas y la variabilidad genética, o deriva, en estas poblaciones. Discuten varios ejemplos de patrones de crecimiento en comunidades de hongos o bacterias (colonias y biopelículas). Demuestran cómo los efectos estocásticos a nivel de una sola célula (impedimento estérico o velocidad de crecimiento) junto con patrones de crecimiento simples pueden afectar la deriva genética a nivel de población. Esto, a su vez, retroalimenta los patrones de crecimiento, lo que lleva a efectos dramáticos como "digitación" (región sobresaliente de crecimiento más rápido). Concluyen que los patrones espacio-temporales deben tenerse en cuenta al estudiar la deriva genética y proponen estudiar la retroalimentación entre la formación de patrones y la dinámica evolutiva. Esta extensión del enfoque de la biología de sistemas desde la escala celular a la poblacional podría finalmente permitir la predicción y el control potencial de los procesos evolutivos.

En la contribución final del tema, Alon y colaboradores [17] estudian la distribución de polimorfismos genéticos (diferencias) cuando los organismos evolucionan bajo múltiples tareas que requieren compensaciones fenotípicas. Muestran que la selección de múltiples tareas crea polimorfismos que se alinean con el llamado "frente de Pareto". Esta línea de politopos conecta los vértices que describen los fenotipos óptimos para tareas individuales y delimita la región de compromiso "óptimo" entre diferentes tareas. Combinando teoría y simulaciones, demuestran que los polimorfismos que se vuelven prevalentes en una población bajo selección multitarea tienen efectos fenotípicos pleiotrópicos que se alinean con el frente de Pareto. Esta estructura especial permite que el apareamiento produzca descendientes que tienen una buena probabilidad de ser multitarea óptimos.


Membranas lipídicas

Uno de los principales intereses de investigación de nuestro grupo ha sido la estructura y el comportamiento de las fases de las membranas lipídicas. La membrana celular es una barrera selectivamente permeable entre la célula y su entorno externo y consta de una bicapa lipídica. Las membranas lipídicas son un ejemplo de un material blando autoensamblado que exhibe un comportamiento de fase rica. Nuestro grupo está interesado en aplicar nuestros estudios de estructura de membranas para abordar cuestiones de biología celular y desarrollar nuevos materiales bioinspirados.

Miembros del grupo que participan en un experimento de difracción de rayos X en el laboratorio nacional de Brookhaven

Algunos proyectos recientes del laboratorio incluyen:

  • La separación de fases y la formación de dominios inducidos por fluorescencia en membranas lipídicas ternarias.

“Comportamiento de fase y fenómenos críticos en mezclas ternarias de lípidos” L.S. Hirst, P. Uppamoochikkal y C. Lor, CRISTALES LÍQUIDOS, vol. 38, 11-12, 1735-1747 (2011) Enlace

“La difracción de rayos X sincrotrón en solución revela detalles estructurales de los dominios lipídicos en mezclas ternarias” J. Yuan, A. Kiss, Y.H. Pramudya, L.T. Nguyen y L.S. Hirst, PHYS. RVDO. E. 79 (3) 031924 (2009) Enlace

"Los efectos de las sondas fluorescentes en la organización de la membrana modelo: clasificación de lípidos fotoinducida y formación de estructuras blandas" L.S. Hirst y J. Yuan, CRISTALES LÍQUIDOS, 36, 6, 739 (2009) Enlace

"Discos de bicapa lipídica y túbulos con bandas: clasificación de lípidos fotoinducida en mezclas ternarias" J. Yuan, S. Hira, G. Strouse y L.S. Hirst, J. AM. CHEM. SOC. 130 (6), 2067-2072, 2008, Enlace

“Transición morfológica en vesículas lipídicas por orden en el plano y defectos topológicos” L.S. Hirst, A. Ossowski, M. Fraser, J. Geng, J.V. Selinger y R.L.B. Selinger, PROC. NATL. ACAD. SCI. 110 (9) 3242-3247 (2013) Enlace

“Plataforma de trampa de fibra óptica en un chip para sondear biomateriales de contraste de índice de refracción bajo” T.M. Pinon, A. Castelli, L.S. Hirst y J.E. Sharping, ÓPTICA APLICADA,52 (11), 2340 – 2345 (2013) Enlace

“Estabilidad de trampas de fibra óptica de doble haz para partículas de contraste de bajo índice de refracción” J. E. Sharping, T.M. Pinon y L.S. Hirst, CLEO: Aplicaciones y tecnología, OSA Technical Digest, Optical Society of America, (2013) Enlace

Nuestro último proyecto en este campo es una colaboración con el profesor Jing Xu de UC Merced en el que estamos analizando el papel de la composición de la carga de membrana en el transporte intracelular a través de motores kinesin.


Ver el vídeo: BIOLOGIA 2 MEMBRANAS LIPIDOS (Mayo 2022).